章一菡，宋洪杰，蔡 溱，卞艷芳，辛海量

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433)

肝癌、食管癌、腸癌和肺癌等腫瘤屬中醫(yī)“癌病”、“積證”、“癥瘕”等范疇，氣滯、血瘀、痰凝、濕濁、癌毒等病理變化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因所在，其基本病機(jī)為毒瘀搏結(jié)，故解毒抗癌、活血散結(jié)為臨床主要治法之一。第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科臨床用于惡性腫瘤防治的解毒方由貓人參、石見穿、山慈菇和雞內(nèi)金4味中藥組成。近10年來，已對(duì)解毒方做過較多基礎(chǔ)和臨床研究，證明其可以縮小腫瘤體積，延長(zhǎng)病人生存期[1]。該方貓人參中皂苷類成分對(duì)肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞株均有明顯抑制作用[2]。石見穿系唇形科植物華鼠尾草的地上部分，曾收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(1997年版)，具有清熱解毒、活血止痛的功效，用于急慢性肝炎[3]、腎炎、風(fēng)濕骨痛、癌癥，面神經(jīng)麻痹、白帶異常、痛經(jīng)等癥。前期作者研制了金貓解毒顆粒非標(biāo)制劑，現(xiàn)對(duì)本品中石見穿有效成分丹參素鈉的含量進(jìn)行分析，對(duì)制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀、AUW220D十萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；DL-720超聲波自動(dòng)清洗器(上海之信儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(南京予凱儀器有限公司)；Diamonsil C18色譜柱、EasyGuard C18保護(hù)柱(美國(guó)Dikma公司)。

1.2 試劑和藥品 丹參素鈉對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)121103，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)；甲醇(色譜純，批號(hào)6508AZ02，美國(guó)Dikma公司)；冰乙酸(分析純，批號(hào)20120530)、磷酸(分析純，批號(hào)T20080530，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；高純水、金貓解毒顆粒(批號(hào)110320、110321、110322，第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 (1)對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品10.28 mg，置10 ml容量瓶中，以高純水溶解，定容，即得濃度為1.028 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存待用。(2)供試品溶液 取金貓解毒顆粒約0.5 g，精密稱定，置10 ml具塞試管中，精密加入10 ml高純水，密封，稱重，25 ℃超聲處理(功率600 W，頻率60 kHz)1 h，放冷，以高純水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱：EasyGuard C18柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰乙酸 (10∶ 90)；柱溫：26 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算不<5000，丹參素鈉的保留時(shí)間為13.72 min,與相鄰色譜峰分離度>1.5，色譜峰拖尾因子在0.95～1.05，色譜圖見圖1。

圖1 丹參素鈉的HPLC譜圖

2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取丹參素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用高純水稀釋成濃度分別為514.0、411.2、308.4、205.6、102.8、51.4 μg/ml的系列溶液，取10 μl 注入HPLC儀，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=5 529.6c+12 917，r=0.999 0(n=6)，線性范圍：51.4～514.0 μg/ml。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為205.6 μg/ml的丹參素鈉對(duì)照品溶液10 μl，注入HPLC儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果平均峰面積的RSD為0.3%(n=6)，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取10 μl供試品溶液,分別于0、3、6、9、12、24 h注入HPLC儀測(cè)定，結(jié)果平均峰面積的RSD為2.02%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下(2)方法制備供試品(批號(hào)110320)溶液，共6份，取10 μl 注入HPLC儀測(cè)定，計(jì)算丹參素鈉的含量。結(jié)果平均含量的RSD為1.53%(n=6)，表明重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批樣品(批號(hào)110320)9份，置10 ml容量瓶中，加入1.02 mg/ml的丹參素鈉對(duì)照品溶液適量，用高純水定容至刻度，樣品處理和測(cè)定方法同前。結(jié)果平均加樣回收率為(99.27±2.80)%，RSD為2.80%(n=9),表明該方法回收率良好。

2.8 樣品含量測(cè)定 按2.1項(xiàng)下(2)方法制備供試品溶液，取10 μl注入HPLC儀，計(jì)算3個(gè)批次金貓解毒顆粒中丹參

素鈉的含量，結(jié)果批號(hào)為110320、110321、110322的金貓解毒顆粒中丹參素鈉的含量分別為(3.00±0.12)、(3.04±0.16)、(3.12±0.18) mg/g，RSD分別為4.02%、5.34%和5.77%(n=3)。

3 討 論

由于金貓解毒顆粒中貓人參、山慈菇和雞內(nèi)金的活性成分尚未明確，故選擇了臣藥石見穿中有活血祛瘀作用的活性成分丹參素鈉作為含量測(cè)定的指標(biāo)。

本研究對(duì)色譜條件進(jìn)行了考察，包括比較甲醇-0.1%磷酸 (10∶90)、甲醇-0.5%冰乙酸(10∶90)、甲醇-1%冰乙酸(10∶90)、甲醇-1%冰乙酸(8∶92)等流動(dòng)相系統(tǒng)[4-6]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.5%冰乙酸(10∶90)溶液為流動(dòng)相，丹參素鈉與其他色譜峰可以達(dá)到基線分離，峰形良好，在51.4～514.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法精密度高、重復(fù)性好，滿足金貓解毒顆粒中丹參素鈉定量分析要求。

測(cè)定結(jié)果表明，3批金貓解毒顆粒中丹參素鈉含量均>3.0 mg/g，同時(shí)考慮到石見穿藥材質(zhì)量差異較大，暫將本品中的丹參素鈉含量限度定為不得<2.0 mg/g，待大生產(chǎn)中積累數(shù)據(jù)，再進(jìn)行修訂。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Zhai XiaoFeng, Chen Zhe, Li Bai,etal.Traditional herbal medicine in preventing recurrence after resection of small hepatocellular carcinoma: a multicenter randomized controlled trial[J]. J Integr Med,2013,11(2): 90-100.

[2] 葉 春.貓人參的研究概述與利用[J].中國(guó)藥業(yè)，2011,20(6):68.

Ye Chun.An overview on research and application of the roots ofActinidiavalvata[J].China Pharmaceuticals, 2011,20(6):68.In Chinese.

[3] 鄭海音，武一曼，林信富，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)石見穿多糖誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,19(3)：20-21.

Zheng HaiYin,Wu YiMan,Lin XinFu,etal.Detection of apoptosis of hepatoma cells induced bySalviachinensisBenth. polysaccharides with flow cytometry[J].J Fujian Univ Tradit Chin Med,2009,19(3)：20-21.In Chinese with English abstract.

[4] 解世全，王 巍，趙煥君.HPLC測(cè)定丹黃祛瘀膠囊中丹參素鈉的含量[J].廣州化工，2012,40(15):157-158.

Xie ShiQuan,Wang Wei,Zhao HuanJun.Determination of sodium Danshensu in Danhuang Quyu capsules by HPLC[J].Guangzhou Chem Ind,2012,40(15):157-158.In Chinese with English abstract.

[5] 章金鳳，李佳林，張麗華.HPLC法測(cè)定三味益肝顆粒中丹參素鈉的含量[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2012，(1):64-66.

Zhang JinFeng,Li JiaLin,Zhang LiHua.Determination of sodium Danshensu in Sanweiyigan granules by HPLC method[J].J Med Pharm Chin Minorities,2012,(1):64-66.In Chinese with English abstract.

[6] 李艷麗，張 虹，陳湘玲，等.高效液相色譜法測(cè)定止眩通脈膠囊中丹參素鈉的含量[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,43(11):832-834.

Li YanLi,Zhang Hong,Chen XiangLing,etal.Determination of contents of sodium Danshensu in Zhixuantongmai capsules by HPLC[J].J Shanxi Med Univ,2012,43(11):832-834.In Chinese with English abstract.