鄧旭坤，蔣 捷，蔡 爽，陳旅翼， 林親雄，梅之南，吳 非， 高康麗

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

江邊一碗水是小檗科植物南方山荷葉(DiphylleiasinensisLi)的根莖，分布于湖北、甘肅、陜西、云南、四川等省，是土家族常用的民族藥材，其根莖具有祛風(fēng)濕、活血止痛、消瘀散腫、清熱解毒和抗癌的功能[2]，常用于風(fēng)濕腰腿疼痛、跌打損傷、癰腫瘡癤、毒蛇咬傷等疾病的治療[3].鬼臼毒素是江邊一碗水的主要活性成分之一，具有明顯的抗病毒、抗腫瘤活性[4]，用于治療HPV引起的尖銳濕疣以及生殖器感染等疾病[5,6].江邊一碗水的毒性較強(qiáng)，臨床常有使用中毒的報(bào)道[9]，恰當(dāng)?shù)闹兴幣谥瓶善鸬胶芎玫臏p毒、增效、緩和藥性，易于服用等作用[7].筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)和實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)[8]，土家醫(yī)在臨床使用前通常要對(duì)藥材采用童便浸泡制、醋蒸制、醋炙制、姜汁制、醋磨制等炮制方法進(jìn)行處理[8]，本文以高效液相色譜法檢測(cè)江邊一碗水生品和炮制品中鬼臼毒素的含量變化，比較了這5種炮制方法對(duì)其活性成分含量的影響，為土家藥“江邊一碗水”炮制工藝的優(yōu)化和規(guī)范化提供了一定的科學(xué)依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Ultimate 3000 型,美國(guó)戴安)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE 52-98型, 上海亞榮生化儀器廠)，循環(huán)真空泵(SHZ-III型,上海亞榮生化儀器廠)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-OAB 型,天津市泰斯特儀器有限公司)，超純水機(jī)(ASWO-0005-M 型, 重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)，電子天平(CP 214 型,奧豪斯儀器上海有限公司)，電磁爐(廣東康寶電器有限公司).

1.2 試藥

鬼臼毒素對(duì)照品(本實(shí)驗(yàn)室自制，由面積歸一化測(cè)定其含量為94.5%)，江邊一碗水 (產(chǎn)于湖北神農(nóng)架林區(qū)，購(gòu)于亳州市颯楓中藥飲片有限公司，由中南民族大學(xué)萬(wàn)定榮教授鑒定為南方山荷葉DiphylleiasinensisLi.的根莖)，甲醇(色譜純, 美國(guó)Tedia Company)，氯仿、甲醇(分析純,天津博迪化工股份有限公司).

2 樣品的制備

參考文獻(xiàn)[8]，得出江邊一碗水各炮制方法的較優(yōu)條件[8].江邊一碗水生品：除去雜質(zhì)，潤(rùn)透后切薄片晾干.童便浸泡法：將25 g生品浸入約120 mL童便中1周后，取出晾干；醋蒸炮制品：將25 g生品切片、用30%米醋悶潤(rùn)1h后置于鍋內(nèi)蒸制2 h后，曬干備用；醋炙炮制品：將25 g生品切片，用30%米醋悶潤(rùn)2h后，在150 ℃下炒 4 min，曬干備用；姜汁炮制品：將適量生姜榨汁，取25 g生品切片，用120 mL姜汁浸泡至透，曬干備用；醋磨炮制品：取生品根莖25 g，與適量食醋共磨、研粉，曬干備用.

3 方法與結(jié)果

3.1 江邊一碗水鬼臼毒素的含量測(cè)定

3.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18 色譜柱(4.6×250mm);流動(dòng)相：甲醇-磷酸二氫鉀水溶液(0.l moL/L, 45︰55); 柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；進(jìn)樣量：10 μL[10].色譜結(jié)果見(jiàn)圖1.

3.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在P2O5干燥器中減壓干燥12 h的鬼臼毒素對(duì)照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成約5.0 mg/mL的溶液，作為鬼臼毒素儲(chǔ)備液.再精密吸取儲(chǔ)備液2 mL，加甲醇制成約1.0mg/mL的溶液，搖勻，微孔濾膜(0.45mm)過(guò)濾，即得對(duì)照品溶液[11].

3.1.3 供試品溶液的制備

取生品和各炮制品粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，加氯仿50 mL，置水浴中加熱回流1 h，放冷，過(guò)濾，濾液揮干氯仿后，加甲醇溶解，過(guò)濾，濾液定容于50 mL量瓶中，微孔濾膜過(guò)濾，得6組供試品溶液[11].

a) 對(duì)照品; b) 生品; 1) 鬼臼毒素圖1 鬼臼毒素與生品HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatograph of podophyllotoxin and Diphylleia sinesis

3.1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4，1，2，3，4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積.以對(duì)照品溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得線性方程為：Y=77.626X-0.0274(r=0.9998).說(shuō)明鬼臼毒素在0.2～2 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

3.1.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次.測(cè)定峰面積，RSD=0.9933%.

3.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將同一供試品溶液，在上述色譜條件下于0, 3, 6, 9, 12 h 分別進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積.結(jié)果鬼臼毒素的峰面積的RSD=1.693%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定(n=5).

3.1.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一藥材粉末樣品0.2 g，按照2.1.3項(xiàng)方法制得供試品溶液6份，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積RSD=1.393%.

3.1.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的江邊一碗水粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定，加入鬼臼毒素對(duì)照品適量，按3.1.3項(xiàng)制成供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可見(jiàn)，鬼臼毒素的平均價(jià)樣回收率為99.0% (RSD=1.919%)，結(jié)果表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠.

表1 鬼臼毒素加樣回收率考察

3.2 樣品測(cè)定

精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)得峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2. 由表2可見(jiàn)，不同炮制品中鬼臼毒素的含量由大至小分別是：醋炙品>醋蒸品>醋磨制品>生品>童便浸泡制品>姜汁制品.

表2 5種炮制品中鬼臼毒素的含量

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-磷酸二氫鉀水溶液(0.l moL/L)為流動(dòng)相時(shí)，易造成色譜柱堵塞，柱壓過(guò)高.但是用水溶液代替磷酸二氫鉀會(huì)導(dǎo)致其分離效果不佳，本文每次進(jìn)樣采集后，先用水-甲醇溶液(9︰1)洗脫5 min，再用甲醇-磷酸二氫鉀水溶液(0.l moL/L, 45︰55)平衡，以保證較佳的分離效果.

恩施被稱為“硒都”，蘊(yùn)藏著舉世罕見(jiàn)的硒資源和各種土家藥[12]，土家藥“江邊一碗水”的活性成分鬼臼毒素具有顯著的抗腫瘤和抗病毒活性[13]，已被《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》列為定量控制的指標(biāo)性成分[11].筆者通過(guò)5種不同炮制方法得到各炮制品，其中鬼臼毒素含量依次為：醋炙品>醋蒸制品>醋磨制品>生品>童便浸泡制品>姜汁制品，.故醋炙法可使江邊一碗水炮制品藥材中的鬼臼毒素的提取率顯著提高.本研究結(jié)果為江邊一碗水炮制工藝的規(guī)范化研究提供了一些的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù).

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 蔣雨玲,史君星,張友恩,等.“江邊一碗水”對(duì)小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定[J].臨床急診雜志,2012,13(1):25-26,29.

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