陳思禮，龔鳳嬌，田 申

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

在魚腥藻PCC7120中，鐵元素的代謝途徑由基因fur(furric uptake regulator)編碼的鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur調(diào)控.PCC7120基因組中有3種同源Fur基因,分別編碼3種蛋白：FurA, FurB和FurC. FurC不與啟動(dòng)子結(jié)合，而是通過影響前兩種蛋白與DNA靶位點(diǎn)結(jié)合的能力[1]，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)與鐵代謝相關(guān)基因的表達(dá)[2].Fur是典型的負(fù)調(diào)控因子.當(dāng)亞鐵離子富足時(shí)，為避免過量金屬對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，F(xiàn)ur與亞鐵離子結(jié)合成聚合物，占據(jù)調(diào)控區(qū)域，阻遏該基因表達(dá)；當(dāng)亞鐵離子貧乏時(shí)，未結(jié)合到亞鐵離子的Fur蛋白不能順利結(jié)合到DNA調(diào)控序列，則相關(guān)的基因表達(dá)開啟.此外，F(xiàn)ur還對異形胞分化，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和氧化還原平衡等功能相關(guān)的基因有重疊調(diào)控作用[3]，還能抵御氧化脅迫和其它環(huán)境脅迫[4].

此次研究克隆出魚腥藻PCC7120FurC基因(alr0957)，成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-fur,并在大腸桿菌BL21中表達(dá)出了帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，并通過設(shè)計(jì)不同F(xiàn)e3+濃度梯度，探討不同鐵離子濃度對藻類生長的影響,為進(jìn)一步該蛋白研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻種和細(xì)菌菌株

魚腥藻Anabaenasp.PCC 7120購于中科院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB).大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.

1.2 載體質(zhì)粒及其他試劑

pET-28a(+)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，pMD18-T載體(Takara公司)，DNA聚合酶(Fermentas公司)，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(Takara公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Axygene公司)， PCR引物合成和基因序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.3 基因組DNA提取

PCC7120基因組DNA提取對傳統(tǒng)酚氯仿作了改進(jìn).離心收集對數(shù)期藻細(xì)胞，無菌水清洗1次，重懸于100 mmol/L EDTA(pH 8.0)，80 μL 50 mg/mL溶菌酶至終濃度2 mg/mL，37 ℃水浴約37 min，置于-20 ℃冰柜冷藏約30 min，反復(fù)數(shù)次直至溶液呈藍(lán)綠色.加入SDS至終濃度1.5%，60 ℃水浴10 min至溶液變黃以充分裂解.再利用酚氯仿法對DNA進(jìn)一步分離純化.嚴(yán)格按照分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作[5].

1.4 引物設(shè)計(jì)與基因克隆

為便于克隆，在引物F1:5′-CGGGATCCTATGCAGCAACAGGCAATATC-3′和R1:5′-CCCAAGCTTCTACTCTTCATCTTGAGGATGC-3′中分別添加BamH I和Hind III酶切位點(diǎn).PCR反應(yīng)體系中含2.5μL 10×Taq buffer，引物各1μL，1μL dNTPs，2μL模板DNA，1μL DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)足到25 μL.PCR反應(yīng)程序如下： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性40 s，65 ℃～50 ℃復(fù)性40 s(每循環(huán)下降0.5 ℃)，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；95 ℃變性40 s， 50 ℃退火40 s，72℃延伸1 min， 15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.DNA凝膠回收層析柱純化回收目的片段.與載體pMD18-T連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，轉(zhuǎn)化子涂布于含氨芐青霉素LB平板上，并用藍(lán)白斑篩選陽性克隆.經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒提取、雙酶切等初步鑒定，送測序通過序列比對得以確定.

1.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

測序正確后，分別對pMD18-T-fur、pET-28a(+)提質(zhì)粒，并由雙酶切、回收目的片段在T4 DNA連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于卡那抗性LB平板上，篩選陽性克隆，送測序以確定.

1.6 重組蛋白的體外表達(dá)

將含pET-fur的重組菌BL21接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)約3 h至OD600≈0.5，加入1 mmol/L的IPTG于37℃下?lián)u床培養(yǎng)18 h，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá).離心收集沉淀，加入2×SDS凝膠緩沖液和還原性保護(hù)劑β-巰基乙醇，沸水浴5 min，離心取上清，用SDS-PAGE電泳檢測外源蛋白質(zhì)的分子量.

1.7 蛋白的純化

用鎳柱層析純化pET系列載體表達(dá)產(chǎn)物.IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體，用Binding Buffer(BB)溶解，超聲裂解30 min后離心去除雜質(zhì)，取上清，離心后得包涵體.用含尿素的BB洗包涵體，將上清溶解液上柱，平衡柱子后進(jìn)行柱層析，分管收集，每管2 mL.

1.8 Fe3+對魚腥藻生長的影響

1.8.1 藻生長密度的測定

配制200 mL培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行樣品(配方略).接種10 mL對數(shù)期Anabaenasp.PCC 7120藻培養(yǎng)液至培養(yǎng)基中，使初始濃度在OD730≈0.5.接種好的藻液在25℃光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)箱光照強(qiáng)度為2000 lux、光暗比為14 h︰10 h，每日輕輕震蕩數(shù)次，從次日起，每天同一時(shí)間測定OD730，觀察其生長情況.以生理鹽水為參比溶液，測定魚腥藻Anabaenasp.PCC 7120生長曲線.每個(gè)濃度的測量最終值取3個(gè)平行樣品的均值.

1.8.2 葉綠素含量的測定

取10 mL藻細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.45μm微孔濾膜抽濾，轉(zhuǎn)移藻細(xì)胞至研缽中，加入6 mL 90%乙醇溶液，冰上充分研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入刻度試管中，4 ℃靜置12 h進(jìn)行暗反應(yīng)， 4000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清至10 mL試管，向沉淀中加4 mL 90 %乙醇，靜置1h后再4000 r/min離心15 min，合并兩次提取的上清.以90 %乙醇作參比，在波長664 nm下測吸光度值，取每組平均值.計(jì)算葉綠素含量的公式為[6]：葉綠素濃度(mg/L)=(OD664×1000)/34.5。

1.8.3 蒽酮比色法測定總糖含量

制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，620 nm比色得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式(y=1.0093x-0.0177,y為蒽酮比色法測得的OD620，如表1).離心管收集培養(yǎng)至第7天的藻液，4 ℃ 9000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 mol/L、pH 6.8的Tris-HCl緩沖液3 mL懸浮洗滌沉淀，4 ℃ 9000 r/min離心5 min，重復(fù)一次.菌體重懸于5 mL預(yù)冷的超聲破碎細(xì)胞緩沖液中充分破碎細(xì)胞，取1 mL細(xì)胞破碎液，加4 mL蒽酮試劑混合均勻，沸水中煮沸10 min，取出后流水冷卻，室溫放置10 min，使之顯色穩(wěn)定，620 nm比色.根據(jù)測得OD620值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算藻的糖含量.

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋梯度

2 結(jié)果

2.1 FurC(alr0957)基因的克隆

用touchdown PCR的方法從魚腥藻Anabaenasp.PCC 7120基因組DNA中成功擴(kuò)增得到450 bp的目的片段，如圖1所示.將目的片段連接到pMD18-T載體上，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化和重組子篩選.經(jīng)鑒定測序，證明成功克隆了FurC基因.通過序列分析比對，可知該基因含有450 bp的開放閱讀框，編碼149個(gè)氨基酸，其相對分子量為17380.

M：DNA Marker 2000；1～3) PCR產(chǎn)物圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis identification of PCR product

2.2 重組表達(dá)載體pET-Fur的構(gòu)建與鑒定

pMD-Fur經(jīng)過BamH I/Hind III雙酶切后，與pET-28a(+)相連接，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，篩選陽性表達(dá)質(zhì)粒.通過PCR、酶切初步鑒定均成陽性.經(jīng)測序與NCBI公布的序列完全一致，說明成功構(gòu)建了pET-Fur. IPTG對其在體外進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).

2.3 融合蛋白的表達(dá)檢測及純化

樣品經(jīng)超聲破碎并離心后，分別對上清和沉淀作SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明：表達(dá)出的蛋白可溶性較低，大部分存在于離心后的沉淀部分，因?yàn)槟康牡鞍孜挥谄扑榈募?xì)胞膜上或產(chǎn)生了包涵體，在上清中濃度很低.FurC含17328個(gè)氨基酸，由于pET-FurC所表達(dá)的融合蛋白其N端帶有T7-tag的11個(gè)氨基酸殘基序列MASMTGGQQMG和1個(gè)多聚組氨酸標(biāo)簽，故預(yù)測該融合蛋白大小約為19 kD.如圖2所示，融合蛋白pET-Fur獲得了成功表達(dá).經(jīng)過一系列蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，基本滿足蛋白純化的條件，利用鎳柱層析法純化FurC.

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1) 普通菌株BL21；2) 含pET-28 a (+)空載體的BL21；3) 未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET-Fur；4) 經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；5) 經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒圖2 重組蛋白pET-Fur的SDS-PAGE檢測 Fig.2 The SDS-PAGE assay of expressed pET-Fur

2.4 Fe3+對魚腥藻生長的影響

通過設(shè)計(jì)不同F(xiàn)e3+濃度對魚腥藻PCC7120的生長影響實(shí)驗(yàn)，研究藻細(xì)胞在生長過程中葉綠素和可溶性糖含量的變化，結(jié)果見圖3.圖3a中不同濃度的Fe3+影響下，PCC7120生長速率有較明顯差異.在0.1 ～0.5 mg/L時(shí)低濃度Fe3+對魚腥藻PCC 7120的生長有較明顯的促進(jìn)作用，藻的生長在第3天出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，斜率增加進(jìn)入對數(shù)期，且Fe3+濃度越高，藻的生長狀況越好，0.5 mg/L濃度為適合生長濃度.當(dāng)Fe3+濃度大于0.9 mg/L時(shí)，隨濃度的升高，藻的生長速率逐漸減慢，生長量減少；當(dāng)Fe3+濃度為4.0 mg/L時(shí)，藻的生長率與低濃度Fe3+藻培養(yǎng)液相比，生長速率明顯低于后者，甚至低于缺鐵組，7d后生長量依然最低，故高濃度的鐵對其生長有明顯的抑制作用.

a～c)不同F(xiàn)e3+濃度下PCC 7120生長曲線、葉綠素a含量和可溶性糖含量圖3 不同F(xiàn)e3+濃度下魚腥藻Anabaena sp. PCC 7120生長指標(biāo)的變化 Fig.3 Growth index changes in Anabaena sp.PCC 7120 treated with different concentrations of Fe3+

圖3b中，當(dāng)Fe3+濃度小于 0.5 mg/L，隨Fe3+濃度的增加，葉綠素含量遞增；但當(dāng)Fe3+濃度大于0.9 mg/L時(shí)，鐵離子對葉綠素a的合成受到了高濃度鐵的脅迫作用，此時(shí)葉綠素a含量隨著Fe3+濃度的增大而減少，與藻培養(yǎng)液顏色變化一致. 圖3c中， Fe3+濃度梯度對糖含量影響與生長趨勢和葉綠素a含量的變化非常類似.由于Fe是糖分解、合成代謝途徑中的功能蛋白(如異檸檬酸脫氫酶)的重要組分，故糖含量在低Fe3+時(shí)隨其濃度升高而增加，一旦超出需要的范圍，則糖合成代謝被抑制，表現(xiàn)為隨Fe3+濃度增加而遞減.

3 討論

目前證實(shí)在E.coli中，F(xiàn)ur基因控制90多種鐵依賴性基因的表達(dá)，包括降解/合成鐵載體的有關(guān)的酶類、鐵載體受體、調(diào)控蛋白、膜載體、金屬還原酶等基因[7].而Fur蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的生理代謝過程.

本文成功地將魚腥藻PCC7120的alr0957(FurC)基因克隆并構(gòu)建到表達(dá)載體pET-28a(+)上得到重組質(zhì)粒pET-Fur，在37℃下經(jīng)1 mmol/L誘導(dǎo)18 h，成功表達(dá)了融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測圖與預(yù)期一致，大小約19 KD.通過優(yōu)化表達(dá)條件實(shí)現(xiàn)了FurC蛋白的純化，為FurC基因的功能進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ).

鐵是藻類生長代謝的必需元素，但鐵濃度過高又會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞滲透性增加，甚至引起藻類形態(tài)的變異[8].不同F(xiàn)e3+濃度影響魚腥藻Anabaenasp. PCC7120的生長，其生長量和生長速率、葉綠素a含量、可溶性糖含量隨Fe3+濃度變化先增后減，說明低濃度鐵對藻的生長起促進(jìn)作用，而超過一定濃度(本實(shí)驗(yàn)為0.9 mg/L)則為抑制作用.故治理藻類污染時(shí)，除了要注意控制氮、磷等大量元素外，還要考慮鐵等微量元素的調(diào)控作用.

參 考 文 獻(xiàn)

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