覃永華，徐 鑫，王春臺

(中南民族大學 生命科學學院 武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074 )

流式細胞術(FCM)是應用流式細胞儀對處于液流中的各種熒光標記的微粒進行多參數快速準確定性、定量測定的方法，它可直接獲取細胞核DNA含量，間接獲取細胞的倍性[1-4].生物體的單倍體基因組所含DNA總量 (簡稱C值)是研究種群進化、物種分類、親緣關系和生態(tài)學的有用分析工具和證據[5]，可通過測定C值來鑒定雜交物種[6].由于植物在生長發(fā)育和抵抗外界不良環(huán)境的過程中，會發(fā)生基因組拷貝數增加[7](多倍性)和基因組擴增[8](核內再復制)，故倍性鑒定可用于評估和分析組織細胞在不同生長環(huán)境下的細胞分裂活動.

目前，流式細胞術已廣泛應用于植物和動物細胞核DNA含量和倍性的測定，但其在水稻中的應用仍不成熟，由于解離液與水稻材料不匹配使解離效果不好、碎片多、大細胞易破碎，準確性差.盡管已有解離液LB01和Otto成功提取水稻單一組織細胞核的實驗報道[9,10]，但由于水稻不同部位組織結構存在顯著差異，往往需要用不同解離液解離才能獲得良好效果，因為水稻葉片表面有較厚的角質層，纖維含量較高，細胞內次生代謝物多，細胞核的懸液制備較困難[11].本文以3種其他物種中成功報道的分離緩沖液為參考，制備了水稻的細胞核懸液，通過比較以篩選出適用于水稻不同組織細胞核流式細胞術分析的最佳緩沖液，改善水稻細胞核分離效果，為快速、準確鑒定出水稻不同組織細胞核DNA含量和倍性提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

流式細胞儀(FACSCalibur, 美國Backman公司).以水稻(Oryzasativa. L)品種中花11為研究對象，取在MS培養(yǎng)基中正常生長2周的幼苗葉、根尖以及大田中授粉15 d后的種子為實驗材料.

細胞核分離緩沖液緩沖液I (Tris-MgCl2buffer)：200 mM Tris，4 mM MgCl2·6H2O，0.5% (v/v) TritonX-100，pH 7.5.細胞核分離緩沖液II ( Lysis buffer，LB01)：15 mM Tris，2 mM Na2EDTA，0.5 mM 四鹽酸精胺，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1%(v/v)TritonX-100，15 mMβ-巰基乙醇，pH7.0～8.0，-20 ℃下保存，用時解凍.細胞核分離緩沖液III (Otto buffer)︰Otto I含100 mM 檸檬酸，0.5%(v/v)Tween20，pH 2.0～3.0；OttoII含400 mM Na2HPO4·12H2O，pH 8.9.解離液的組成為V(Otto I)︰V(Otto II)= 2︰1，棄上清后加Otto I[9,10,12].

1.2 細胞核懸液制備

參考文獻[13]，取1 g 正常生長2周的水稻苗幼葉，用蒸餾水洗凈，濾紙吸干后放入預冷的培養(yǎng)皿里，加入預冷的解離液1 mL Otto buffer，用鋒利刀片快速切碎，將材料浸沒在解離液里.用400目的濾膜將浸有材料的解離液過濾到1.5 mL離心管中，置于4 ℃孵育5 min.在1000 r/min，4 ℃離心5 min.棄上清后，再加入200 μL預冷的解離液Otto I，同時加入10 μL預冷的染料1 μg/μL PI(使用濃度50 μg/mL)和1 μL的10 μg/μL RNase母液(使用濃度50 μg/mL)，每個樣品共約 200 μL細胞核懸浮液.

1.3 流式細胞術分析測定

參考文獻[14]，經PI染色的每個樣品通過流式細胞儀測定20000個細胞核.利用CellQuest ProTM軟件獲取數據，并通過ModFit LT軟件顯示直方圖(橫坐標以DNA相對含量，縱坐標為細胞核個數)，計算G0/1峰的變異系數[CV(%) = 標準差/平均值×100].根據未知樣本和標準樣本圖中峰值的相對位置，確定未知樣本的染色體倍性.一般CV值小于3%～5%，表示結果準確.

2 結果

2.1 不同緩沖液的效果比較

不同緩沖液獲得的水稻幼葉細胞核相對DNA含量結果見圖1.由圖1可見，使用這3種緩沖液制備的水稻幼葉細胞核懸浮液，經流式細胞儀分析測定均可產生非常明顯的峰，但圖1a中，在2C的主峰的左側出現明顯的干擾峰，同時收集到完整的細胞核相對較少.圖1b結果較圖1a好，除未見雜峰外，完整細胞核的收集也相對要多.圖1c結果最好，未見雜峰，主峰出現了2C和4C兩峰，并且能收集到大量的完整細胞核.緩沖液I、II、III的CV值分別為9.02 %、6.13 %、4.57 %，CV值越小，峰圖效果越好.

a) 緩沖液I；b) 緩沖液II；c) 緩沖液III圖1 不同緩沖液獲得的二周齡水稻苗幼葉細胞核相對DNA含量Fig.1 The relative DNA contents of cell nuclei isolated from young leaf of two weeks-old rice seedling by different buffer solutions

2.2 用Otto緩沖液對不同組織的鑒定效果

采用Otto buffer分離緩沖液制備水稻根尖和種子的細胞核懸浮液，基于流式細胞儀檢測DNA峰值的位置可確定樣品的倍性，結果見圖2.由圖2可見，根尖細胞的峰圖2a中出現了較高的2C峰外，還出現了較低的4C峰，橫坐標(DNA含量)也顯示出4C是2C的兩倍.峰圖表明根尖特別是分生區(qū)細胞分裂旺盛，除了存在二倍體2C細胞外，還存在大量待分裂的四倍體4C細胞.圖2b中種子的DNA含量檢測顯示了3個峰值，分別為2C、3C和4C，其中2C含量最高，4C最少；橫坐標所顯示的DNA含量和倍性水平是對應的.種子中除了含有大量已分裂的二倍體細胞2C和少量待分裂的四倍體4C細胞外，由于胚乳細胞是三倍體，所以其DNA含量為3C，其DNA值也正好介于2C和4C之間.以上結果說明Otto buffers可作為一種較好的緩沖液分離完整的細胞核.

a) 根尖；b) 種子圖2 水稻根和種子細胞核相對DNA含量Fig.2 The relative DNA contents of cell nuclei isolatedfrom root and seed in rice

3 討論

流式細胞術可用于DNA含量和倍性的檢測，對研究植物進化、親緣關系和細胞分裂活動具有重要的參考意義.常規(guī)的染色體計數法測定水稻倍性不僅對技術要求很高，而且由于水稻細胞核較小或染色體對數多，要得到準確的結果有很大難度.流式細胞術可很好地解決這一難題，但由于水稻組織細胞自身結構的特異性造成了很難選取合適的解離液用于水稻不同組織細胞核DNA含量和倍性的測定[4]，故制備一種合適的緩沖液用于流式細胞檢測水稻細胞十分必要.

本文通過流式細胞技術比較了3種緩沖液制備水稻組織細胞核懸液的DNA的效果，結果表明：緩沖液III(Otto buffer)制備的細胞核懸液能成功地鑒定出水稻不同組織部位的倍性水平.同時，該緩沖液也可用于水稻根尖和種子的DNA含量和倍性的研究，為類似的研究提供了參考.但該緩沖液也存在著有不足之處，例如，在種子胚乳中應存在6C的細胞核，但是實驗中未形成明顯的波峰，可能是緩沖液對維持細胞核的完整性不夠.不同植物的組織結構和化學成分存在較大差異，解離液與待測植物樣本可能不匹配.當解離液不匹配待測植物時，非但不能保持細胞核完整，還會加速細胞核破碎.故對不同植物要選擇不同的細胞核分離緩沖液，或改變緩沖液成分來維持細胞核的完整性以獲得較高分辨率.

參 考 文 獻

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