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        氧化石墨烯/Fe3O4復合材料固定辣根過氧化物酶催化去除酚類廢水

        2014-08-06 01:12:14唐和清
        關鍵詞:二氯酚類苯酚

        唐和清,黃 佳,常 青

        (中南民族大學 化學與材料科學學院,武漢430074)

        辣根過氧化物酶(HRP)是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白,在過氧化氫(H2O2)存在時能催化氧化酚類物質產生苯氧自由基,自由基相互聚合,形成可通過沉淀或過濾除去的不溶性聚合物[1,2],故被廣泛運用于酚類廢水的去除.酚類化合物是一類原型質毒物,與細胞原漿中的蛋白質作用,使人和動物中毒[3].在煤炭轉化、紡織、樹脂和塑料加工、洗滌劑、煉油、鋼鐵、木材、肥皂、洗滌劑、燃料和其他有機化學品等工業(yè)領域中酚類物質被廣泛運用[4].

        HRP催化氧化酚類物質的作用機理第一步是H2O2和靜態(tài)酶中的Fe(III)反應生成化合物I(HRPI),HRPI是一個高氧化態(tài)的催化中間體,包含一個含氧Fe(IV)中心和一個帶正電荷的卟啉.一分子還原性底物的加人,生成另一個含有含氧Fe(IV)中心的催化中間體HRPII.HRPI 和HRPII都是強氧化劑,氧化還原電勢接近+1V.第二步也有一分子還原性底物參加,使HRPII還原成靜態(tài)酶[5].在傳統(tǒng)的含酚廢水酶促處理中,大多使用的是溶液酶,易受廢水中其他污染物的影響,穩(wěn)定性差、易失活、不能繼續(xù)使用.固定化酶不僅可解決酶的回收、再利用等問題,還提高酶的穩(wěn)定性和酶對環(huán)境的適應能力,對于耐酸、耐堿、耐高溫等耐極端條件酶的開發(fā)具有重要意義[6].

        1 實驗部分

        1.1 樣品、試劑和儀器

        苯酚、2,4-二氧苯酚、七水硫酸亞鐵、六水氯化鐵、氨水、聚乙二醇、高錳酸鉀、4-氨基安替比林(4-AAP)、鐵氰化鉀、EDC (分析純,國藥集團化學試劑有限公司),HRP(R.Z≥3.1, 上海雪滿生物科技有限公司).

        高效液相色譜儀(HPLC U-3000型,Thermo Scientific公司), 傅立葉紅外光譜儀( Nicolet Nexus 470 型, Thermo Nicolet 公司),振動樣品磁強計(ADE 4HF, Dymek公司).

        1.2 GO/Fe3O4復合材料的制備

        由hummer法制備氧化石墨[7].量取30 mL已知濃度的氧化石墨超聲30 min,稱取0.466 g FeCl3·6H2O和0.48 g FeSO4·7H2O與之混合超聲10 min.逐滴滴入20 mL 2.5 mol·L-1的氨水溶液中,60 ℃超聲反應60 min,多次洗滌后,50 ℃真空干燥箱中烘干備用.

        1.3 HRP的固定

        在18 mL pH=6 的磷酸緩沖液中加入0.2 g GO/Fe3O4和2 mg HRP放入100 mL錐形瓶中,超聲10 min后,加入EDC使其終濃度為2 mg·L-1,于150 r/min、30 ℃的搖床中反應11 h(見圖1).反應完成后用緩沖液反復洗滌排除未固定化的酶的干擾,定容后保存.

        圖1 EDC將HRP固定在GO/Fe3O4上的示意圖Fig.1 Schematic illustration of HRP immobilized on GO/Fe3O4 by EDC

        1.4 酶活的測定

        在反應器皿里加入100 μL的0.2 mol·L-1苯酚,100 μL的4.8 mol·L-1的4-AAP,200 μL 2.0 mmol·L-1H2O2,適量的pH為7.4磷酸緩沖溶液和酶溶液,終溶液體積為1.8 mL.在紫外可見分光光度計下檢測其在505 nm處的吸光度[8].

        1.5 酚類物質分析方法

        用高效液相色譜(HPLC)測定分析酚類物質的濃度,檢測條件為UV檢測器,色譜柱為C-18 (規(guī)格5 μm, 150×4 mm).流動相是甲醇和水體積比例為60∶40,流速0.8 mL·min-1,在270 nm 和288 nm雙波長檢測.

        1.6 酚類物質的去除

        在100 mL的錐形瓶中加入固定化酶(酶活0.1 U),酚類物質(1 mmol·L-1),H2O2(1.5 mmol·L-1),聚乙二醇(按照與酚類物質的質量比為0.4添加),pH=6.4的磷酸緩沖溶液(25 mmol·L-1),反應總體積40 mL,在25℃下反應3 h.

        2 結果與討論

        2.1 材料的表征

        GO/Fe3O4復合材料的磁化曲線為"S"型曲線,結果見圖2.如圖2所示,所測的矯頑力(1.17 Oe)和剩磁(73.06×10-3emu·g-1)幾乎可忽略不計,證實為超順磁材料.飽和磁化強度Ms是25.96 emu·g-1.純的Fe3O4飽和磁化強度約為68.8 emu·g-1[9],GO/Fe3O4中Fe3O4的質量所占比例約為37.7%.HRP固定在具有磁性的GO/Fe3O4復合材料,可利用磁場作用將固定化酶與反應溶液分離供下一次循環(huán)使用.

        Appiled Field/(104 Oe)圖2 GO/Fe3O4復合材料多的磁化曲線Fig.2 Magnetization curve of GO/Fe3O4

        GO/Fe3O4、GO/Fe3O4-HRP 和純的HRP的紅外光譜圖見圖3.由圖3可見,1586 cm-1處吸收峰是由于Fe3O4覆蓋在GO表面而形成了-COO的緣故,F(xiàn)e-O的伸縮振動峰在560 cm-1,與之前的報道相似[10].當酶固定后,1398 cm-1附近的-OH 的面內變型振動吸收峰基本消失(見圖3b).與GO/Fe3O4復合材料的譜圖相比,GO/Fe3O4-HRP在1102 cm-1處有一個新峰出現(xiàn),純的HRP的譜圖中同樣具有這一個峰,歸屬于C-N 的伸縮振動,故推斷HRP成功地固載在GO/Fe3O4復合材料表面.

        五四時期,除了本土的封建主義意識形態(tài),附著于各種思潮的西方意識形態(tài)也涌入中國,如功利主義(實用主義)、無政府主義、基爾特社會主義、新村主義,等等,宣揚著各自對社會的見解和主張。在各種主義中,有的標榜贊成“共產主義”或“社會主義”,但其內容和實質卻是偽社會主義或反馬克思主義的,一時讓人難辨真假,阻礙著馬克思主義的科學社會主義的傳播。馬克思主義與一些反馬克思主義的意識形態(tài)進行了較長時間的論戰(zhàn),比較著名的是與功利主義(實用主義)、基爾特社會主義、無政府主義的論爭。

        σ/cm-1a) GO/Fe3O4; b) GO/Fe3O4-HRP; c) 純HRP圖3 不同樣品的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared spectra of different samples

        2.2 酚類的去除

        2.2.1 單獨的苯酚與2,4-二氯苯酚的去除

        固定化酶去除苯酚和2,4-二氯苯酚廢水結果見圖4.如圖4所示,苯酚與2,4-二氯苯酚的去除率約為46%和99%.2,4-二氯苯酚在反應開始10 min后就基本去除完成,隨時間延長苯酚的去除率逐漸增加,直至120 min才基本保持不變.在反應過程中苯氧自由基攻擊酶的活性位點使酶失活[11],是由于生產的苯氧自由基對酶的毒性不同所致.

        t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚圖4 固定化酶去除苯酚與2,4-二氯苯酚Fig.4 Removal of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

        2.2.2 苯酚與2,4-二氯苯酚混合溶液的去除

        在HRP的作用下,H2O2將酚氧化生成高活性的苯氧自由基等中間物種,它們從酶的活性中心擴散到溶液,與酚分子或其它苯氧自由基本身發(fā)生反應,生成了一系列的聚合物.將相對較難被HRP氧化去除的酚類與相對較容易去除的酚類混合,由于去除途徑的增多會提高難以去除的酚類的去除效率[12].在實際酚類廢水的處理中,因廢水不只含有一種酚類物質,去除混合溶液更有實際意義.實驗將固定化酶用于處理苯酚(0.5 mmol·L-1)與2,4-二氯苯酚(0.5 mmol·L-1)水溶液的混合物,結果見圖5.如圖5所示,2, 4-二氯苯酚的去除率還保持99%,而苯酚的去除率從之前的46%提高到93%,故2, 4-二氯苯酚與苯酚混合后能促進苯酚的去除.

        t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚圖5 固定化酶去除苯酚與2,4-二氯苯酚的混合物Fig.5 Removal of mixed solution of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

        2.2.3 理化性質對混合酚類去除的影響

        配置不同pH值的磷酸緩沖溶液(25 mmol·L-1),其他條件不變,考察pH對去除效率的影響,結果如圖6a所示.圖6a中,在pH值為5.4~6.4范圍內,隨pH值的增加去除率增加;在pH值為6.4~9.4范圍內,去除率隨pH值增加而減小.酶蛋白分子上有很多酸性、堿性氨基酸殘基,隨pH的變化處于不同的解離狀態(tài)會直接影響與底物的結合或者影響酶的空間結構使酶失活,因此最適pH值為6.4.溫度對去除率的影響結果見圖6b. 圖6b中,隨著溫度的升高,苯酚的去除率與2,4-對氯酚的去除率都逐漸下降,溫度為60℃時苯酚與2,4-二氯苯酚的去除率分別只有29%和49%,因為酶的活性受溫度影響很大,溫度過高時會變性,經優(yōu)化后以25℃為最佳反應溫度.

        pH θ/℃圖6 pH與溫度對去除率的影響Fig.6 The influence of pH and temperature on the removal rate

        2.2.4 固定化酶的循環(huán)利用

        固定化酶的回收利用是評價酶固定化方法的一個重要指標,實驗將制備的固定化酶用于混合的苯酚與2,4-二氯苯酚的催化去除,重復4次,每次3h,反應完成后用水多次洗滌固定化酶以便下一次實驗.Zhang 等[13]證實自由酶在酚類物質的催化去除反應體系中迅速失活. 固定化酶循環(huán)使用去除混合酚溶液結果見圖7.由圖7可見,固定化酶在多次長時間使用后活性仍然保持了原有活性的約50%,酶的固定顯著增加了HRP在酚類物質催化去除中的應用價值,使固定酶在實際廢水處理中的使用成為可能.

        Cycles圖7 固定化酶循環(huán)使用去除混合酚溶液的活性Fig.7 Reusability of the immobilized enzyme in mixed solution of phenols removals

        3 結論

        (1)采用原位反相共沉淀的方法制備了GO/Fe3O4復合材料,以EDC為交聯(lián)劑運用共價交聯(lián)的方法將HRP成功固定在GO/Fe3O4復合材料上.

        (2)固定化酶用于去除單獨的苯酚與2,4-二氯苯酚和兩者的混合溶液,易于去除的2,4-二氯苯酚與苯酚混合后對苯酚的去除起到了促進作用,提高了苯酚的去除率.

        (3)固定化酶重復用于苯酚與2,4-二氯苯酚混合溶液的去除, 4次循環(huán)后固定化酶的活性保留超過50%.

        參 考 文 獻

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