李宏宇 李曉姝 王立生 楊月峰 郭曉鐘

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與其細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)控有關(guān)，并與細(xì)胞壞死、凋亡及自噬存在密切聯(lián)系。Beclin1基因參與細(xì)胞自噬的調(diào)控，在腫瘤形成及發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[1-3]。研究提示，胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞存在Beclin1自噬基因的缺陷，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞逃避自噬性死亡，且發(fā)現(xiàn)某些抗腫瘤藥物可能通過(guò)自噬機(jī)制在腫瘤治療方面發(fā)揮作用，但在胰腺癌方面尚缺乏相關(guān)的研究報(bào)道。吉西他濱是目前用于治療胰腺癌的一線藥物。本研究觀察吉西他濱對(duì)Beclin1基因沉默的人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa-2細(xì)胞周期及凋亡的影響，為胰腺癌的基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成3條靶向Beclin1基因的siRNA(siBecl)、陰性對(duì)照siRNA(siNC)及熒光標(biāo)記的siRNA(siFAM)。篩選干擾效果最好的siBecl序列構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒U6/Neo-siBec1、陰性對(duì)照質(zhì)粒pGPU6/Neo-siNC及熒光對(duì)照質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siFAM。載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。

人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa-2由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，常規(guī)條件下培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用Lipofectamin2000(Invitrogen 公司)將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。先瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，48 h，再在培養(yǎng)上清液中加入400 μg/ml的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3～4 d，換含G418的培養(yǎng)液一次，18 d后收集細(xì)胞，提取蛋白，置-20℃冰箱保存。

此外，轉(zhuǎn)染siBecl的MiaPaCa-2細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入0.4 μg/ml吉西他濱(法國(guó)禮來(lái)公司)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以未加吉西他濱處理的轉(zhuǎn)染siBecl的MiaPaCa-2細(xì)胞作為對(duì)照。

二、Beclin1蛋白和mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Beclin1蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。兔抗Beclin1單抗為Reagents 公司產(chǎn)品，兔抗Actin抗體以及羊抗兔IgG多抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

應(yīng)用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取各組細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Beclin1mRNA表達(dá)，RT-PCR試劑盒為Fermentas(中國(guó))公司產(chǎn)品。根據(jù)GenBank的Beclin1基因上游調(diào)控區(qū)序列，由Invitrogen 公司合成Beclin1引物，上游序列5′-GGTGTCTCTCGCAGATTCATC-3′，下游序列5′-TCAGTCTTCGGCTGAGGTTCT-3′。 以β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 20 s、65℃ 20 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。60～90℃間每升溫0.2℃維持2 s。mRNA表達(dá)量通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算，以shNC轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)量為1.0。

三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞至EP管，1 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。加入1 ml預(yù)冷PBS，輕輕震蕩以懸浮細(xì)胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。在各管中加200 μl Binding Buffer，輕輕吹懸，再各加入10 μl Annexin V-FITC(北京眾康志恒生物公司)，輕輕混勻，移至玻璃試管中，室溫避光反應(yīng)15 min。加入300 μl Binding Buffer、10 μl PI，反應(yīng)5 min后(1 h內(nèi))上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

四、細(xì)胞周期分析

收集轉(zhuǎn)染shBecl及shNC后48 h的細(xì)胞及經(jīng)吉西他濱處理24 h的轉(zhuǎn)染shBecl的細(xì)胞至EP管，1 000 r/min 4℃離心10min，棄上清，同上法用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，加入70%乙醇(PBS稀釋)4℃固定24 h，1 000 r/min 4℃離心5 min后去上清，PBS洗2次，移至玻璃試管中，加入2 μl RNase(10 mg/ml)、0.5%的PI ，4℃避光20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

通過(guò)波長(zhǎng)480 nm的藍(lán)光激發(fā)，F(xiàn)AM-siRNA在熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光(圖1)。轉(zhuǎn)染率達(dá)75%。

圖1 FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞后6 h的光鏡(a)及熒光鏡(b)圖(×100)

二、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Beclin1蛋白和mRNA的表達(dá)

3條siBecl插入質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染插入siBecl-3質(zhì)粒的MiaPaCa-2細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)最低(圖2)，抑制效果最佳。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均取該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行。

圖2 陰性對(duì)照siRNA(1)及3條靶向Beclin1基因的siRNA(2、3、4)轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞48 h后Beclin1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染siNC質(zhì)粒細(xì)胞的Beclin1 mRNA表達(dá)量為1.0，轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒細(xì)胞的Beclin1 mRNA表達(dá)量為0.295，表達(dá)明顯受到抑制(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒48 h后MiaPaCa-2細(xì)胞Beclin1 mRNA的表達(dá)

三、吉西他濱對(duì)Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細(xì)胞的S、G2期細(xì)胞數(shù)較轉(zhuǎn)染siNC質(zhì)粒的MiaPaCa-2細(xì)胞減少，而G1期細(xì)胞增多(表1)。轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細(xì)胞經(jīng)吉西他濱處理后，其S期細(xì)胞數(shù)較吉西他濱未處理的轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細(xì)胞進(jìn)一步減少，而G1、G2期細(xì)胞增多(表1)。

四、吉西他濱對(duì)Beclin1 基因沉默的MiaPaCa-2細(xì)胞凋亡的影響

Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細(xì)胞經(jīng)吉西他濱處理后，細(xì)胞凋亡率被顯著抑制(0.06%比29.13%，P<0.01，圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)染siNC(a)和轉(zhuǎn)染siBec1(b)細(xì)胞經(jīng)吉西他濱處理后的凋亡細(xì)胞數(shù)

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞無(wú)限增殖和凋亡受抑制的結(jié)果，自噬與凋亡之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系，并參與腫瘤發(fā)生的調(diào)控。Beclinl主要通過(guò)與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合體的途徑調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，從而調(diào)節(jié)自噬活性[4]。Beclin1有4個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，它們分別與UVRAG、Vps34、Ambra1、Bcl-2蛋白形成復(fù)合體，其中Bcl-2與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合后對(duì)自噬起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[5]。已有研究顯示，Beclin1與凋亡抑制因子Bcl-2相互發(fā)生作用，并與Bcl-2蛋白的拮抗因子Bax以及Bax相互作用因子-1(Bif-1)作用均可以促進(jìn)細(xì)胞自噬，其中Bif-1通過(guò)UVRAG與Beclin1相互結(jié)合，正向調(diào)節(jié)PI3K通路。Beclin1基因缺失或Bif-1基因敲除后腫瘤的形成率顯著增高。自噬對(duì)于腫瘤凋亡究竟起促進(jìn)作用還是抑制作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，Beclin1基因沉默后MiaPaCa-2細(xì)胞的凋亡未受到明顯影響，提示可能存在更為復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。有研究顯示，處于G0、G1期的腫瘤細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增加，通過(guò)其抑制細(xì)胞凋亡而延長(zhǎng)生存期，增加癌基因突變的可能性[6]。本研究也顯示，Beclin1基因沉默后明顯影響了腫瘤細(xì)胞的周期分布，但是否與Bcl-2的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

表1 轉(zhuǎn)染siBecl及siNC的Mia PaCa-2細(xì)胞給于吉西他濱處理前后的細(xì)胞周期分布

吉西他濱是一種目前用于治療胰腺癌療效顯著的細(xì)胞周期特異性抗代謝類抗癌藥。它主要作用于DNA合成期(即S期)的腫瘤細(xì)胞，也可以阻斷細(xì)胞由G1期向S期進(jìn)展。它在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)核苷激酶轉(zhuǎn)化為具有活性的二磷酸鹽(dFdCDP)和三磷酸鹽(dFdCTP)，抑制DNA的合成。本研究結(jié)果顯示，吉西他濱處理Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于S期，提示Beclin1的沉默可能影響了吉西他濱的正常生物學(xué)效應(yīng)，即Beclin1可能有拮抗吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。當(dāng)然亦可能由于質(zhì)粒中的序列片段影響了吉西他濱抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成的途徑。雖然Beclin1基因沉默對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞的凋亡未產(chǎn)生影響，但卻明顯抑制了吉西他濱誘導(dǎo)的MiaPaCa-2細(xì)胞凋亡。Wen等[7]報(bào)道，自噬與Caspase依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)生相關(guān)，Beclin1可通過(guò)增強(qiáng)Caspase-9的活性參與化療藥物CDDP誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞MKN28的凋亡；腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配基TRAIL在人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A組織的形成過(guò)程中，誘導(dǎo)自噬形成也伴隨著Caspase依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)生[8]。本基因中Beclin1抑制吉西他濱誘導(dǎo)的MiaPaCa-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制是否可能通過(guò)Caspase途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)尚需進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Qu X, Yu J, Bhagat G, et al. Promotion of tumorigenesis byheterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene[J]. J Clin Invest, 2003, 112(2):1809-1820.

[2] Amaravadi RK, Yu D, Lum JJ, et al. Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma[J]. J Clin Invest, 2007, 117(2):326-336.

[3] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature, 2008, 451(7182):1069-1075.

[4] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12): 2445-2462.

[5] Sinha S, Levine B. The autophagy effector Beclin 1: a novel BH3-only protein[J]. Oncogene,2008,27(Suppl1):S137-S148.

[6] Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proleterati, and anglogenesis during human colorectal tumorigenesis[J]. Cancer, 2001, 91(11): 2026-2032.

[7] Wen X, Lin ZQ, Liu B, et al. Caspase-mediated programmed cell death pathways as potential therapeutic targets in cancer[J]. Cell Prolif, 2012, 45(3): 217-224.

[8] Marquez RT, Xu L. Bcl-2:Beclin 1 complex: multiple, mechanisms regulating autophagy/apoptosis toggle switch[J]. Am J Cancer Res, 2012, 2(2): 214-22.