鄒金艷 商建 易三鳳 伍威 林軍

Wnt/β-catenin信號(hào)通路直接影響胰腺癌細(xì)胞的增殖、分化和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活[1-4]。β-catenin在胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)及胰腺癌蛋白的核內(nèi)高度積聚[5]。文獻(xiàn)報(bào)道[6]，非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NASIDs)能抑制結(jié)腸癌組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制β-catenin的核聚集及β-catenin/TCF靶基因的轉(zhuǎn)錄。但NASIDs對(duì)胰腺癌的作用目前少有研究。本研究應(yīng)用NASIDs的舒林酸處理人胰腺癌細(xì)胞PANC1，觀察其對(duì)PANC1細(xì)胞增殖、凋亡及Wnt信號(hào)通路成員β-catenin表達(dá)的影響。

一、材料和方法

1．細(xì)胞增殖測(cè)定：人胰腺癌細(xì)胞PANC1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，應(yīng)用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的舒林酸(美國(guó)Enzo公司)分別處理PANC1細(xì)胞24、48、72 h，以不加舒林酸的細(xì)胞作為對(duì)照組。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，按MTT試劑盒(江蘇碧云天生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)操作。最后上酶標(biāo)儀測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值(A490值)。生長(zhǎng)抑制率=實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值×100%。

2．細(xì)胞凋亡測(cè)定：取不同濃度舒林酸處理48 h的PANC1細(xì)胞，常規(guī)消化制備細(xì)胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。染色完成后1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3．β-catenin mRNA表達(dá)檢測(cè)：利用Primer Express1.5軟件設(shè)計(jì)β-catenin引物，序列為5′-GTGCTATCTGTCTGCTCTAGTA-3′及5′-CTTCCTGTTTAGTTGCAGCATC-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAAGT-3′及5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。 引物由上海生工合成。取不同濃度舒林酸處理24 h的PANC1細(xì)胞以及2 mmol/L舒林酸處理12、24、48、72 h的PANC1細(xì)胞，采用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示mRNA表達(dá)量。

4．β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè)：取不同濃度舒林酸處理24、48 h的PANC1細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片，采用免疫組化SP法檢測(cè)β-catenin蛋白。兔抗人β-catenin多抗購(gòu)自Santa Cruz公司，生物素化羊抗兔IgG購(gòu)自武漢天興生物科技有限公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢天興生物科技有限公司。在400倍顯微鏡下閱片，按“米”字形隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)胞質(zhì)和胞核呈棕黃色的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞1%～30%計(jì)1分，31%～70%計(jì)2分，71%～100%計(jì)3分；根據(jù)著色強(qiáng)度依次計(jì)0、1、2、3分，兩分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[7]。

二、結(jié)果

1．舒林酸對(duì)PANC1細(xì)胞增殖的影響：應(yīng)用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸處理后，PANC1細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度抑制，與陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為80.755、91.701、134.087，P值均<0.05)，但1.5和2.0 mmol/L舒林酸處理48、72 h時(shí)的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.348、0.843)，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1、圖1)。

表1 舒林酸作用PANC1細(xì)胞后A490均值及抑制率

圖1 不同濃度舒林酸處理后PANC1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2．舒林酸對(duì)PANC1細(xì)胞凋亡的影響：應(yīng)用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸處理PANC1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞早期凋亡率分別為(6.6±0.7)%、(9.3±1.4)%、(23.7±1.2)%、(29.4±0.9)%，隨舒林酸濃度增加，凋亡率亦隨之增加，其中0.5、1.0 mmol/L處理組與對(duì)照組的(6.5±0.3)%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.792、0.288)，1.5、2.0 mmol/L組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為189.432、164.400，P值均<0.05，圖2)。

圖2 對(duì)照組(a)及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b、c、d、e)處理48 h后PANC1細(xì)胞的凋亡

3．舒林酸對(duì)細(xì)胞β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)的影響：PANC1細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)量隨著舒林酸濃度的增加而下調(diào)，對(duì)照組及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L組的β-catenin mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.96±0.03、0.92±0.04、0.52±0.09、0.35±0.09，0.5、1.0 mmol/L組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.322、0.074)，而1.5、2.0 mmol/L組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。2.0 mmol/L舒林酸處理PANC1細(xì)胞12、24、48、72 h，細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)量分別為0.44±0.02、0.30±0.05、0.16±0.01、0.16±0.04，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，均較對(duì)照組的0.60±0.02下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=192.408，P<0.05，圖3)。

細(xì)胞的β-catenin蛋白表達(dá)亦隨著舒林酸濃度的增加逐漸降低，其中0.25、0.5 mmol/L處理組與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.472、0.586)，而1.0、1.5、2.0 mmol/L處理組與對(duì)照組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2，圖4)。

圖3 0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(1、2、3、4、5)處理24 h后(a)及2.0 mmol/L舒林酸處理0、12、24、48、72 h(1、2、3、4、5)后(b)細(xì)胞β-Catenin mRNA的表達(dá)

表2 不同濃度舒林酸對(duì)人胰腺癌PANC1細(xì)胞β-catenin表達(dá)影響

圖4 對(duì)照組(a)及0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b～f)處理24 h后細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)(免疫組化 ×400)

討論NSAIDs是常用的解熱鎮(zhèn)痛消炎藥物，近年來(lái)研究證明NSAIDs還能對(duì)腫瘤有化學(xué)預(yù)防的作用，尤其是在結(jié)、直腸癌預(yù)防方面。Peter等對(duì)17 285名需要口服阿司匹林預(yù)防心血管疾病的患者平均隨訪(fǎng)6.5年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿司匹林能降低腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是結(jié)直腸腺瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。Stein等[9]應(yīng)用舒林酸處理不同結(jié)腸癌細(xì)胞系，結(jié)果能降低細(xì)胞β-catenin的表達(dá)及核聚集，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中舒林酸能降低腫瘤的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與β-catenin及其下游轉(zhuǎn)錄激活基因S100A4表達(dá)減少有關(guān)。他們認(rèn)為舒林酸通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin信號(hào)通路具有抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示，舒林酸呈濃度依賴(lài)及時(shí)間性抑制PANC1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。但在藥物處理48 h后的細(xì)胞增殖抑制效果不如48 h前明顯，可能與藥物消耗及細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)下降相關(guān)。RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)舒林酸處理后PANC1細(xì)胞的β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，在1.5及2.0 mmol/L舒林酸處理后細(xì)胞基本不表達(dá)β-catenin蛋白，與舒林酸對(duì)肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的影響相似。

[1] White BD, Chien AJ, Dawson DW. Dysregulation of Wnt/β-catenin signaling in gastrointestinal cancers[J]. Gastroenterology, 2012, 142(2): 219-232.

[2] Vermeulen L, De Sousa E Melo F, Van der Heijden M, et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12(5): 468-476.

[3] Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, et al. Integrative transcriptome analysis reveals common molecular subclasses of human hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2009, 69(18): 7385-7392.

[4] MacDonald BT,Tamai K,He X.Wnt/beta-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J].Dev Cell,2009,17(1):9-26.

[5] 滿(mǎn)曉華, 王偉, 鄭建明, 等. β-連環(huán)蛋白在不同胰腺病變中的表達(dá)[J]. 中華胰腺病雜志, 2012, 12(1): 26-29.

[6] Din FV, Theodoratou E, Farrington SM, et al. Effect of aspirin and NSAIDs on risk and survival from colorectal cancer[J]. Gut, 2010, 59(12): 1670-1679.

[7] Kirikoshi H, Katoh M. Expression of WNT7A in human normal tissues and cancer, and regulation of WNT7A and WNT7B in human cancer[J]. Int J Oncol, 2002, 21(4): 895-900.

[8] Rothwell PM, Wilson M, Price JF, et al. Effect of daily aspirin on risk of cancer metastasis: a study of incident cancers during randomised controlled trials[J]. Lancet, 2012, 379(9826): 1591-1601.

[9] Stein U, Arlt F, Smith J, et al. Intervening in β-catenin signaling by sulindac inhibits S100A4-dependent colon cancer metastasis[J]. Neoplasia, 2011, 13(2): 131-144.