孫菲 李曉宇 張翠萍 徐永紅 武軍 單信芝 趙坤 田字彬

刺參酸性黏多糖(stichopus japonieus acidic mucopolysaccharide，SJAMP)是由刺參體壁提取的一種動物酸性黏多糖，它可以通過抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[1-2]。本研究組曾報道[3]，刺參黏多糖呈時間、劑量依賴性抑制胰腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，但具體機制不明。Hippo信號通路參與調(diào)控器官大小及細胞增殖和凋亡[4]，其抑癌基因失活與人類腫瘤發(fā)生密切相關[5]。本研究應用刺參黏多糖干預胰腺癌SW1990細胞，觀察干預后細胞Hippo信號通路靶基因及相關基因表達的變化，探討其在胰腺癌細胞增殖機制中的作用。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌細胞株SW1990購自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室，刺參黏多糖購自中國海洋大學藥學院，1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，標準胎牛血清購自杭州四季青公司，RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，兔抗人YAP、pYAP、GAPDH一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購自美國Cell Signaling公司。

二、方法

1．細胞培養(yǎng)：人胰腺癌細胞株SW1990常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，每孔1.5×105個細胞。貼壁生長后用8 mg/ml刺參黏多糖分別干預細胞24、48、72 h，以未干預的SW1990細胞作為對照。每組設3個復孔。

2．熒光定量RT-PCR：提取各組細胞的總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測Hippo信號通路靶基因YAP、MST1、Survivin、Caspase-9、TEAD1 mRNA的表達。引物序列：YAP上游序列為3′-TGAACA-AACGTCCAGCAAGATAC-5′，下游序列為3′-CAG-CCCCCAAAATGAACAGTAG-5′；MST1上游序列為3′-AGCCGCAGTTCACGTTTACCT-5′，下游序列為3′-GATCCACCCTCTTGCCACACT-5′；Survivin上游序列為3′-GATGACGACCCCATAGAGGAAC-5′，下游序列為3′-GGGTTAATTCTTCAAACTGCTTCT-5′；Caspase-9上游序列為3′-AACAGGCAAGCAGCAAAGTT-5′，下游序列為3′-CACGGCAGAAGTTCACATTG-5′；TEAD1上游序列為3′-CAAGGTTTGAGAATGGCCGAT-5′，下游序列為3′-AAACACACAGGCCATGCAGAG-5′。內(nèi)參GAPDH上游序列為3′-CACCAGGGCTGCTTTTAA-CTC-5′，下游序列為3′-TGGAAGATGGTGATGGGA-TTT-5′。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。先應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行實時PCR，反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。通過PCR儀自動獲取Ct值，按2-△△Ct的公式計算mRNA表達量。△△Ct=(實驗組目的基因平均Ct值- 實驗組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值)。

3．蛋白質(zhì)印跡法：收集各組對數(shù)生長期細胞，提取總蛋白，采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測YAP、磷酸化YAP(pYAP) 蛋白的表達，以GAPDH為內(nèi)參。兔抗人YAP、pYAP、GAPDH工作濃度1∶6 000，HRP標記的羊抗兔二抗工作濃度1∶3 000，最后ECL顯色， Vilber Fusion Fx7凝膠成像儀攝取圖像，Quantity One軟件測定條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各組SW1990細胞Hippo信號通路靶基因及相關基因mRNA表達的變化

8 mg/ml的刺參黏多糖呈時間依賴性下調(diào)YAP、TEAD1、Survivin mRNA的表達，上調(diào)Caspase-9、MST1 mRNA的表達(圖1，表1)。

圖1 刺參黏多糖處理24 h后SW1990細胞各基因mRNA的表達

表1 各組SW1990細胞各基因mRNA的表達量

二、各組SW1990細胞YAP、pYAP蛋白表達的變化

8 mg/ml的刺參黏多糖呈時間依賴性下調(diào)YAP蛋白的表達，但上調(diào)pYAP蛋白的表達(圖2，表2)。

圖2 對照組(1)及刺參黏多糖干預24(2)、48(3)、72 h(4)組SW1990細胞YAP、pYAP蛋白的表達

表2 各組SW1990細胞YAP、pYAP蛋白的表達量

討 論

2005年Huang等首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路[6]，該通路在進化過程中高度保守，參與調(diào)控細胞增殖和凋亡以及調(diào)節(jié)器官大小[4]，在細胞接觸性抑制(細胞接觸后改變其運動方向)乃至腫瘤的發(fā)生過程中起重要的作用[7]。Hippo通路調(diào)節(jié)異常被認為是引起癌癥發(fā)生的原因之一[8]。哺乳動物的Hippo通路成員有MST、WW45、Lats、Mob1、YAP等。MST(磷酸化蛋白激酶)分為MST1和MST2兩個亞型，是Hippo信號通路中抑制癌癥發(fā)生的關鍵元件[9]。MST2 與MST1蛋白激酶結(jié)構(gòu)相似度88%，二者通過磷酸化負性調(diào)控YAP水平[10]。YAP是Hippo信號通路核心效應因子，是一種候選癌基因，位于人類染色體11q22。YAP轉(zhuǎn)錄輔助活性取決于YAP在細胞內(nèi)的位置。位于細胞核內(nèi)時，它與TEAD轉(zhuǎn)錄激活因子一起共同促使下游轉(zhuǎn)錄因子Cyclin E、 DIAP1等表達增加，啟動基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[11]；YAP磷酸化后轉(zhuǎn)位進入胞質(zhì)，胞質(zhì)中的YAP通過磷酸化的ser127與14-3-3蛋白相結(jié)合而喪失作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子的功能[12]。在多種人類腫瘤中, YAP的表達以及在細胞核的定位都明顯增加[13]。有研究發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP通路在胰腺胚胎發(fā)育過程中起到重要作用，YAP可以維持胚胎中胰腺腺泡細胞正常分化[14]。TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族對YAP導致的腫瘤細胞過度增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起重要作用，其中TEAD1和TEAD2與YAP關系尤為密切[15]。

刺參酸性黏多糖是由刺參體壁提取的一種動物酸性黏多糖，具有抗凝血、抗血栓、降血脂、降低血黏度、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒及促細胞生長等作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，刺參黏多糖可以通過抑制細胞周期因子CyclinD1和CDK4的表達而抑制宮頸癌Hela細胞增殖，通過抑制癌基因c-myc的表達來誘導Hela細胞分化[17]。它可通過抑制細胞增生并誘導凋亡來抑制人肝癌細胞HepG2的生長，通過誘導Bcl-2和nm23-H1蛋白含量的改變來發(fā)揮其抗腫瘤作用[18]。但在胰腺癌中無相關文獻報道。

本研究組以往的研究發(fā)現(xiàn)，刺參黏多糖能抑制胰腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，并呈時間、劑量依賴性[3]。本實驗結(jié)果顯示，隨著刺參黏多糖作用時間的延長， MST1 mRNA水平升高，YAP mRNA水平及蛋白表達水平均逐漸下降，而pYAP蛋白水平逐漸升高，表明刺參黏多糖能激活SW1990細胞Hippo信號通路，并促進YAP磷酸化，從而削弱了YAP作為癌基因的作用，抑制了下游基因的轉(zhuǎn)錄和胰腺癌細胞的增殖。

細胞凋亡主要有兩種通路：一種是以Fas和TNFR為代表的死亡受體信號轉(zhuǎn)導途徑；另一種是以線粒體為核心的凋亡途徑。伴隨著線粒體膜電位的下降，線粒體內(nèi)凋亡活性物質(zhì)如Ca2+、細胞色素C的釋放進而激活位于凋亡途徑上游的Caspase-9，進一步誘導效應Caspase-3的活化，導致Caspase-3發(fā)生斷裂，最終使細胞走向凋亡[19]。Survivin能直接或間接抑制Caspase依賴或Caspase非依賴的凋亡途徑。Survivin與胰腺癌腫瘤大小、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關系。Survivin基因沉默可以使胰腺癌細胞周期阻滯，促進細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，刺參黏多糖作用SW1990細胞后明顯下調(diào)凋亡抑制基因Survivin mRNA和上調(diào)凋亡因子Caspase-9 mRNA，激發(fā)線粒體凋亡途徑，從而促使胰腺癌細胞的凋亡。

綜上所述，刺參黏多糖可以上調(diào)Hippo通路中主要效應因子MST的表達，使得YAP磷酸化增加，從而抑制其癌基因的作用，抑制胰腺癌細胞增殖。同時還可以抑制抑癌基因Survivin的表達，促進Caspase-9介導的細胞凋亡。這可能是刺參黏多糖對胰腺癌的抑制機制。

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