陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 王迪 趙佳鈞 許文達(dá)
胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤,臨床預(yù)后極差[1],治療十分棘手,迫切需要探索新的有效的治療手段。樹突細(xì)胞(dendritic cells, DC)是體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APS),能夠刺激并致敏T淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lynphocytes, CTL ),啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答。以DC為基礎(chǔ)構(gòu)建的腫瘤疫苗對(duì)多型腫瘤均有顯著的免疫治療作用,已成為當(dāng)前腫瘤生物免疫治療的研究熱點(diǎn)之一[2-4]。本研究將胰腺癌相關(guān)抗原MUC1、survivin mRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染DC,觀察其在體外誘導(dǎo)并激發(fā)抗原特異性CTL的能力,為今后胰腺癌多表位抗原DC疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
篩選2012年6月至2013年6月期間沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者,其中男性4例,女性2例,年齡35~65歲,平均年齡50歲。全部患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查(剖腹探查活檢4例,細(xì)針穿刺活檢2例)證實(shí)為胰腺癌。入選前未經(jīng)放、化療及免疫治療。試驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。
人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640、小牛血清購自Hyclone公司,rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α購自PeproTec公司,鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗購自Santa-Cruz公司,Trizol、 MTT、DMSO、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma公司,3H標(biāo)記甲基胸腺嘧啶(3H-TdR)由中科院原子能所提供,IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ細(xì)胞因子檢測試劑盒購自BD公司,sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Qiagen公司。
參照文獻(xiàn)[5]方法,通過Ficoll密度梯度離心法分離來自胰腺癌患者100 ml外周血中的單核細(xì)胞(PBMC),貼壁生長1 h后,取出未貼壁細(xì)胞備用。貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h,更換新鮮培養(yǎng)液,加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml),繼續(xù)培養(yǎng)5 d后加入TNF-α (10 ng/ml),使用倒置顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5~10 d的DC形態(tài)學(xué)變化。收集成熟DC(大部分細(xì)胞培養(yǎng)至7 d即可呈現(xiàn)成熟DC形態(tài)特征),用流式細(xì)胞儀分析DC的特征性標(biāo)志CD40、DC特征性成熟標(biāo)志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達(dá)水平。
人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,應(yīng)用Trizol抽提細(xì)胞總RMA。采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MUC1、survivin及作為內(nèi)參的次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase, HPRT)引物,并經(jīng)Gene bank驗(yàn)證。MUC1引物上游為5′-TGAGTGATGTGC-3′,下游為5′-CTGCCCGTAGTTCTTTCG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物158 bp;survivin引物上游為5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′,下游為5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物171 bp;HPRT引物上游為5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′,下游為5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物221 bp。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再按照T7 mMessage mMachine試劑盒說明書于37℃ 2~4 h體外轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增MUC1和survivin mRNA,沉淀后保存。參考文獻(xiàn)[6]的方法,取200 μl DC細(xì)胞懸液加入2 mm的電極杯,分別加入20 μg MUC1、survivin mRNA及聯(lián)合加入MUC1、survivin mRNA。采用電壓300 V,間隔125 ms,4個(gè)脈沖,持續(xù)250 ms的參數(shù)行電穿孔轉(zhuǎn)染,電穿孔后立刻將電極杯置入4℃冰箱靜置10 min,移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)0~96 h,3組DC分別命名為DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1+survivin。
分別收集3組轉(zhuǎn)染DC,用Trizol提取總RNA,采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測MUC1、survivin mRNA表達(dá),按照QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)條件:95℃ 15 min,94℃ 20 s, 60℃ 20 s,72℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán),最后68℃ 60 s中止反應(yīng)。以未轉(zhuǎn)染DC作為對(duì)照組。根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法,用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量MUC1、survivin mRNA的表達(dá)量。mRNA相對(duì)表達(dá)量=轉(zhuǎn)染DC的目的基因與內(nèi)參基因的濃度比值/未轉(zhuǎn)染DC的目的基因與內(nèi)參基因濃度比值。每個(gè)樣品重復(fù)2次,取均值。同時(shí),使用MTT法檢測DC的存活率。
分別收集3組轉(zhuǎn)染DC作為刺激細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105/ml;收集患者自體PBMC中的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106/ml。按刺激與效應(yīng)細(xì)胞1∶10、1∶20、1∶40和1∶80比例加入到96孔板中,終體積200 μl,常規(guī)培養(yǎng)5 d。以RPMI-1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞作為對(duì)照組。收獲細(xì)胞前18 h加入3H-TdR,每孔1 μCi。使用液閃爍儀檢測每分鐘脈沖數(shù),表示為增殖指數(shù)。每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)復(fù)孔,取均值。
以上述刺激與效應(yīng)細(xì)胞按1∶10比例混合反應(yīng)14 d,以未轉(zhuǎn)染DC與患者自體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)組作為對(duì)照。應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ水平,按試劑盒說明書操作。每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔,取均值。
經(jīng)體外分離、培養(yǎng),DC數(shù)量可達(dá)初始數(shù)量的10~15倍。鏡下見胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起,部分突起末端呈球狀膨大(圖1)。成熟DC的表面標(biāo)志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86呈陽性表達(dá),陽性表達(dá)率分別為34.31%、50.21%、89.17%和73.62%(圖2)。
DC-MUC1的MUC1 mRNA表達(dá)量為36.24±5.17;DC-survivin的survivin mRNA表達(dá)量為34.53±4.02;DC-MUC1+survivin的MUC1、survivin mRNA表達(dá)量分別為31.79±4.26和14.67±2.96,較DC-MUC1及DC-survivin的表達(dá)量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.41、9.68,P值均<0.05)。
圖1 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(左:GIMSA染色 ×200;右:掃描電鏡 ×2 μm)
圖2 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)
DC-MUC1及DC-survivin的存活率穩(wěn)定在80%左右,無明顯變化;DC-MUC1+survivin的存活率呈時(shí)間依賴性下降,96 h時(shí)的存活率降至50.21%,顯著低于DC-MUC1、DC-survivin,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.24、2.97,P值均<0.05,圖3)。
當(dāng)DC與T淋巴細(xì)胞混合比例為1∶10、1∶20時(shí),DC-MUC1+survivin刺激自體T淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著高于DC-MUC1及DC-survivin,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05);而當(dāng)混合比例為1∶40、1∶80時(shí),增殖指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。
圖3 單獨(dú)及聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DCs存活率變化
當(dāng)DC與T細(xì)胞混合比例為1∶10時(shí)孵育14 d,DC-MUC1培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ水平分別為(892.73±32.90)、(436.51±24.16)、(501.62±12.30)、(981.50±47.82)pg/ml;DC-survivin為(713.62±56.37)、(198.29±22.38)、(203.84±12.55)、(696.05±41.66)pg/ml;DC-MUC1+survivin為(1884.37±95.21)、(486.42±33.25)、(1193.15±86.04)、(2237.94±189.55)pg/ml。DC-MUC1+survivin激發(fā)抗原特異性CTL分泌的IL-2、granzyme B、IFN-γ水平顯著高于DC-MUC1與DC-survivin,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.157、5.205、6.114,P值均<0.05);而分泌的IL-10的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
DC腫瘤疫苗的實(shí)質(zhì)是以特異性T淋巴細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫。疫苗構(gòu)建的關(guān)鍵在于選擇適合的腫瘤抗原負(fù)載方式。胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗原,異質(zhì)性大、免疫原性差。使用單腫瘤抗原負(fù)載DC構(gòu)建的胰腺癌腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常較弱;而使用腫瘤全抗原負(fù)載DC構(gòu)建的胰腺癌疫苗有引發(fā)機(jī)體自身免疫疾病發(fā)生的可能。在基于腫瘤個(gè)體化治療的前提下,通過選擇數(shù)個(gè)易受T淋巴細(xì)胞影響的胰腺癌靶點(diǎn)抗原聯(lián)合負(fù)載DC構(gòu)建腫瘤疫苗[8],可能會(huì)在保證安全的同時(shí),達(dá)到誘導(dǎo)較強(qiáng)的機(jī)體特異性抗癌免疫反應(yīng)的目的,理論上是一種較好的DC腫瘤疫苗的構(gòu)建方法。MUC1是高糖基化I型糖蛋白的一種,其蛋白分子較易被免疫細(xì)胞所呈遞和識(shí)別[9]。同時(shí),MUC1的表達(dá)具有高度的腫瘤特異性,在胰腺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)率可達(dá)90%以上,因此被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[10]。此外,近年來的研究發(fā)現(xiàn),一類全新的通用型腫瘤抗原(universal tumor antigens, UTA)幾乎可以表達(dá)于所有的腫瘤細(xì)胞,而在正常組織不表達(dá),因此其表位可以作為重要且廣泛的應(yīng)用性靶目標(biāo),在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮作用[11]。Survivin是UTA的一種,其在胰腺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)率可達(dá)76.9%~88.0%[12]。鑒于survivin表達(dá)的高度腫瘤特異性及其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,survivin也被認(rèn)為是一種重要的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。
表1 各組轉(zhuǎn)染DC刺激自體T淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)
RNA電轉(zhuǎn)染法具有操作簡單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)成功將MUC1和(或)survivin抗原負(fù)載DC,且兩種目標(biāo)mRNA在轉(zhuǎn)染過程中未出現(xiàn)不良交互反應(yīng)。轉(zhuǎn)染后的DC均有MUC1和(或)survivin mRNA的表達(dá),但聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC的表達(dá)水平顯著低于單抗原轉(zhuǎn)染的DC,提示在DC的RNA轉(zhuǎn)染過程中可能存在某種RNA數(shù)量方面的限制,即當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA總量較高時(shí),DC中目標(biāo)抗原的表達(dá)可能并不隨同增高。單抗原轉(zhuǎn)染的DC存活率穩(wěn)定在80%左右,而聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC存活率明顯降低,這可能與DC聯(lián)合轉(zhuǎn)染時(shí)所受電損傷過久以及RNA轉(zhuǎn)染劑量過高引起的毒性增加有關(guān)。
本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC對(duì)自體T淋巴細(xì)胞的增殖刺激能力顯著高于單轉(zhuǎn)染的DC,提示隨著負(fù)載抗原表位的增加,DC刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力亦增強(qiáng)。
各類腫瘤疫苗的最終目的是期望其在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性的CTL,從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)。隨著T淋巴細(xì)胞的增殖和特異性CTL的擴(kuò)增,活化的CTL可分泌大量Th1型的細(xì)胞因子,如IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ等,因此DC對(duì)體外CTL的刺激活化能力可間接使用IFN-γ等細(xì)胞因子的釋放量表示[13]。本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合轉(zhuǎn)染DC激發(fā)CTL的效應(yīng)較單轉(zhuǎn)染DC更強(qiáng),與Van Tendeloo等[14]的研究結(jié)果類似,提示DC體外激發(fā)特異性CTL的能力可能與其所負(fù)載抗原表位的數(shù)目有關(guān),而與轉(zhuǎn)染RNA的劑量無關(guān)。即隨著DC負(fù)載的抗原表位數(shù)量的增加,其體外活化、激發(fā)抗原特異性CTL的能力亦會(huì)顯著增強(qiáng)。
總之,將MUC1與survivin mRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC在體外能顯著促進(jìn)抗原特異性CTL的增殖和活化,為胰腺癌多抗原表位DC疫苗的構(gòu)建與應(yīng)用提供了部分理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
參 考 文 獻(xiàn)
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