陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 王迪 趙佳鈞 許文達

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，臨床預后極差[1]，治療十分棘手，迫切需要探索新的有效的治療手段。樹突細胞(dendritic cells, DC)是體內功能最為強大的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell, APS)，能夠刺激并致敏T淋巴細胞，產生細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lynphocytes, CTL )，啟動機體免疫應答。以DC為基礎構建的腫瘤疫苗對多型腫瘤均有顯著的免疫治療作用，已成為當前腫瘤生物免疫治療的研究熱點之一[2-4]。本研究將胰腺癌相關抗原MUC1、survivin mRNA聯(lián)合轉染DC，觀察其在體外誘導并激發(fā)抗原特異性CTL的能力，為今后胰腺癌多表位抗原DC疫苗的開發(fā)和臨床應用奠定基礎。

材料與方法

一、臨床病例及試劑

篩選2012年6月至2013年6月期間沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，其中男性4例，女性2例，年齡35～65歲，平均年齡50歲。全部患者均經組織病理學檢查(剖腹探查活檢4例，細針穿刺活檢2例)證實為胰腺癌。入選前未經放、化療及免疫治療。試驗經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

人胰腺癌細胞株MiaPaCa-2由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實驗室保存。RPMI-1640、小牛血清購自Hyclone公司，rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α購自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗購自Santa-Cruz公司，Trizol、 MTT、DMSO、Ficoll淋巴細胞分離液購自Sigma公司，3H標記甲基胸腺嘧啶(3H-TdR)由中科院原子能所提供，IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ細胞因子檢測試劑盒購自BD公司，sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Qiagen公司。

二、DC的分離、培養(yǎng)、鑒定

參照文獻[5]方法，通過Ficoll密度梯度離心法分離來自胰腺癌患者100 ml外周血中的單核細胞(PBMC)，貼壁生長1 h后，取出未貼壁細胞備用。貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h，更換新鮮培養(yǎng)液，加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后加入TNF-α (10 ng/ml)，使用倒置顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5～10 d的DC形態(tài)學變化。收集成熟DC(大部分細胞培養(yǎng)至7 d即可呈現(xiàn)成熟DC形態(tài)特征)，用流式細胞儀分析DC的特征性標志CD40、DC特征性成熟標志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達水平。

三、MUC1、survivin mRNA擴增及DCs的轉染

人胰腺癌MiaPaCa-2細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，應用Trizol抽提細胞總RMA。采用Primer premier 5.0軟件設計MUC1、survivin及作為內參的次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase, HPRT)引物，并經Gene bank驗證。MUC1引物上游為5′-TGAGTGATGTGC-3′，下游為5′-CTGCCCGTAGTTCTTTCG-3′，擴增產物158 bp；survivin引物上游為5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′，下游為5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，擴增產物171 bp；HPRT引物上游為5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′，下游為5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′，擴增產物221 bp。先逆轉錄成cDNA，再按照T7 mMessage mMachine試劑盒說明書于37℃ 2～4 h體外轉錄、擴增MUC1和survivin mRNA，沉淀后保存。參考文獻[6]的方法，取200 μl DC細胞懸液加入2 mm的電極杯，分別加入20 μg MUC1、survivin mRNA及聯(lián)合加入MUC1、survivin mRNA。采用電壓300 V，間隔125 ms，4個脈沖，持續(xù)250 ms的參數(shù)行電穿孔轉染，電穿孔后立刻將電極杯置入4℃冰箱靜置10 min，移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)0～96 h，3組DC分別命名為DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1+survivin。

四、轉染DC的MUC1、survivin mRNA表達檢測

分別收集3組轉染DC，用Trizol提取總RNA，采用實時定量PCR法檢測MUC1、survivin mRNA表達，按照QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒說明書操作。PCR反應條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s， 60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)，最后68℃ 60 s中止反應。以未轉染DC作為對照組。根據(jù)文獻[7]的方法，用雙標準曲線法相對定量MUC1、survivin mRNA的表達量。mRNA相對表達量=轉染DC的目的基因與內參基因的濃度比值/未轉染DC的目的基因與內參基因濃度比值。每個樣品重復2次，取均值。同時，使用MTT法檢測DC的存活率。

五、轉染DC刺激自體T淋巴細胞的增殖實驗

分別收集3組轉染DC作為刺激細胞，調節(jié)細胞密度為1×105/ml；收集患者自體PBMC中的T淋巴細胞作為效應細胞，調節(jié)細胞密度為1×106/ml。按刺激與效應細胞1∶10、1∶20、1∶40和1∶80比例加入到96孔板中，終體積200 μl，常規(guī)培養(yǎng)5 d。以RPMI-1640培養(yǎng)基替代效應細胞作為對照組。收獲細胞前18 h加入3H-TdR，每孔1 μCi。使用液閃爍儀檢測每分鐘脈沖數(shù)，表示為增殖指數(shù)。每個樣本設4個復孔，取均值。

六、轉染DC激發(fā)抗原特異性CTL釋放的Th1型細胞因子IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ的檢測

以上述刺激與效應細胞按1∶10比例混合反應14 d，以未轉染DC與患者自體T淋巴細胞反應組作為對照。應用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ水平，按試劑盒說明書操作。每個樣本設2個復孔，取均值。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

經體外分離、培養(yǎng)，DC數(shù)量可達初始數(shù)量的10～15倍。鏡下見胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，部分突起末端呈球狀膨大(圖1)。成熟DC的表面標志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86呈陽性表達，陽性表達率分別為34.31%、50.21%、89.17%和73.62%(圖2)。

二、轉染DC的MUC1、survivin mRNA表達

DC-MUC1的MUC1 mRNA表達量為36.24±5.17；DC-survivin的survivin mRNA表達量為34.53±4.02；DC-MUC1+survivin的MUC1、survivin mRNA表達量分別為31.79±4.26和14.67±2.96，較DC-MUC1及DC-survivin的表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.41、9.68，P值均<0.05)。

圖1 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細胞形態(tài)學表現(xiàn)(左：GIMSA染色 ×200；右：掃描電鏡 ×2 μm)

圖2 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細胞表面標志物的表達

三、轉染DC的存活率

DC-MUC1及DC-survivin的存活率穩(wěn)定在80%左右，無明顯變化；DC-MUC1+survivin的存活率呈時間依賴性下降，96 h時的存活率降至50.21%，顯著低于DC-MUC1、DC-survivin，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為3.24、2.97，P值均<0.05，圖3)。

四、轉染DC刺激自體T淋巴細胞增殖的變化

當DC與T淋巴細胞混合比例為1∶10、1∶20時，DC-MUC1+survivin刺激自體T淋巴細胞的增殖指數(shù)顯著高于DC-MUC1及DC-survivin，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；而當混合比例為1∶40、1∶80時，增殖指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

圖3 單獨及聯(lián)合轉染的DCs存活率變化

五、轉染DC體外激發(fā)抗原特異性CTL釋放細胞因子的變化

當DC與T細胞混合比例為1∶10時孵育14 d，DC-MUC1培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ水平分別為(892.73±32.90)、(436.51±24.16)、(501.62±12.30)、(981.50±47.82)pg/ml；DC-survivin為(713.62±56.37)、(198.29±22.38)、(203.84±12.55)、(696.05±41.66)pg/ml；DC-MUC1+survivin為(1884.37±95.21)、(486.42±33.25)、(1193.15±86.04)、(2237.94±189.55)pg/ml。DC-MUC1+survivin激發(fā)抗原特異性CTL分泌的IL-2、granzyme B、IFN-γ水平顯著高于DC-MUC1與DC-survivin，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.157、5.205、6.114，P值均<0.05)；而分泌的IL-10的差異無統(tǒng)計學意義。

討 論

DC腫瘤疫苗的實質是以特異性T淋巴細胞為基礎的細胞免疫。疫苗構建的關鍵在于選擇適合的腫瘤抗原負載方式。胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗原，異質性大、免疫原性差。使用單腫瘤抗原負載DC構建的胰腺癌腫瘤疫苗誘導的免疫反應通常較弱；而使用腫瘤全抗原負載DC構建的胰腺癌疫苗有引發(fā)機體自身免疫疾病發(fā)生的可能。在基于腫瘤個體化治療的前提下，通過選擇數(shù)個易受T淋巴細胞影響的胰腺癌靶點抗原聯(lián)合負載DC構建腫瘤疫苗[8]，可能會在保證安全的同時，達到誘導較強的機體特異性抗癌免疫反應的目的，理論上是一種較好的DC腫瘤疫苗的構建方法。MUC1是高糖基化I型糖蛋白的一種，其蛋白分子較易被免疫細胞所呈遞和識別[9]。同時，MUC1的表達具有高度的腫瘤特異性，在胰腺癌細胞中的陽性表達率可達90%以上，因此被認為是腫瘤免疫治療的一個重要靶點[10]。此外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一類全新的通用型腫瘤抗原(universal tumor antigens, UTA)幾乎可以表達于所有的腫瘤細胞，而在正常組織不表達，因此其表位可以作為重要且廣泛的應用性靶目標，在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮作用[11]。Survivin是UTA的一種，其在胰腺癌細胞中的陽性表達率可達76.9%～88.0%[12]。鑒于survivin表達的高度腫瘤特異性及其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用，survivin也被認為是一種重要的腫瘤免疫治療靶點。

表1 各組轉染DC刺激自體T淋巴細胞的增殖指數(shù)

RNA電轉染法具有操作簡單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優(yōu)點。本研究采用電轉染技術成功將MUC1和(或)survivin抗原負載DC，且兩種目標mRNA在轉染過程中未出現(xiàn)不良交互反應。轉染后的DC均有MUC1和(或)survivin mRNA的表達，但聯(lián)合轉染的DC的表達水平顯著低于單抗原轉染的DC，提示在DC的RNA轉染過程中可能存在某種RNA數(shù)量方面的限制，即當轉染的RNA總量較高時，DC中目標抗原的表達可能并不隨同增高。單抗原轉染的DC存活率穩(wěn)定在80%左右，而聯(lián)合轉染的DC存活率明顯降低，這可能與DC聯(lián)合轉染時所受電損傷過久以及RNA轉染劑量過高引起的毒性增加有關。

本研究結果顯示，聯(lián)合轉染的DC對自體T淋巴細胞的增殖刺激能力顯著高于單轉染的DC，提示隨著負載抗原表位的增加，DC刺激自體T淋巴細胞增殖的能力亦增強。

各類腫瘤疫苗的最終目的是期望其在體內誘導特異性的CTL，從而對腫瘤細胞產生特異性的殺傷效應。隨著T淋巴細胞的增殖和特異性CTL的擴增，活化的CTL可分泌大量Th1型的細胞因子，如IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ等，因此DC對體外CTL的刺激活化能力可間接使用IFN-γ等細胞因子的釋放量表示[13]。本研究結果顯示，聯(lián)合轉染DC激發(fā)CTL的效應較單轉染DC更強，與Van Tendeloo等[14]的研究結果類似，提示DC體外激發(fā)特異性CTL的能力可能與其所負載抗原表位的數(shù)目有關，而與轉染RNA的劑量無關。即隨著DC負載的抗原表位數(shù)量的增加，其體外活化、激發(fā)抗原特異性CTL的能力亦會顯著增強。

總之，將MUC1與survivin mRNA聯(lián)合轉染的DC在體外能顯著促進抗原特異性CTL的增殖和活化，為胰腺癌多抗原表位DC疫苗的構建與應用提供了部分理論和實驗基礎。

參 考 文 獻

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