林小建， 龔如金， 李 平， 于建國

(華東理工大學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)工程聯(lián)合國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

圖1 氨魯米特對映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of aminoglutethimide enantiomers

纖維素-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)手性固定相(Chiralcel OD-H)具有很高的對映體選擇性，且負(fù)載量大，是目前應(yīng)用較廣泛的一種手性固定相［10-12］。本文采用該固定相在正相色譜條件下研究了氨魯米特對映體的拆分。本文通過測定氨魯米特在兩種流動相體系中的溶解度，優(yōu)選了對樣品溶解度大的流動相體系，并考察了流動相添加劑乙醇胺(MEA)對對映體拆分的影響。在此基礎(chǔ)上研究了流動相中醇含量、柱溫以及進(jìn)樣量對分離因子、分離度、不對稱因子和理論板數(shù)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

制備單一對映體的方法主要有手性合成和手性拆分兩種方法［2，3］。手性合成是以手性物質(zhì)為原料合成其他手性化合物或者在催化劑的作用下合成單一對映體化合物;手性拆分是指使用特定的拆分劑，利用物理、化學(xué)或生物方法將外消旋體拆分成兩個單一對映體。手性色譜拆分法是應(yīng)用最為廣泛的一種手性拆分方法，其中液相色譜拆分法因具有高選擇性、高穩(wěn)定性、高效率等諸多優(yōu)勢，在手性拆分中占有重要地位，已有多篇采用手性固定相在高效液相色譜中拆分手性化合物的報(bào)道［4-6］。

手性固定相法在高效液相色譜中拆分氨魯米特對映體國內(nèi)未見報(bào)道，主要集中于國外的研究。Ali等［7］使用Chiralpak IA手性柱和Chiralpak IB手性柱，分別以甲基叔丁醚-四氫呋喃(THF)(90∶10，v/v)、100%二氯甲烷和100%乙腈為流動相拆分氨魯米特，研究結(jié)果表明Chiralpak IA柱在3種流動相中均能拆分氨魯米特對映體，而Chiralpak IB柱均不能實(shí)現(xiàn)拆分。Aboul-Enein等［8］以正己烷/乙醇(50∶50，v/v)為流動相，使用Chiralcel OD柱對氨魯米特進(jìn)行了拆分，分離因子為1.43。該作者［9］還

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用Dionex 3000高效液相色譜系統(tǒng)(ThermoFisher，美國)由 U3000二元梯度泵、U3000自動進(jìn)樣器、U3000RS柱溫箱、U3000RS紫外檢測器以及Chromeleon6.8色譜工作站組成。2300TH型超聲儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。W5-100SP水浴鍋(上海申生科技有限公司)。手性柱 Chiralcel OD-H(150 mm ×4.6 mm，5 μm)購自日本Daicel公司。

氨魯米特外消旋體(純度＞99.0%)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;1，3，5-三叔丁基苯(TTBB，純度＞98.0%)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;正己烷、乙醇、異丙醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙醇胺(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 色譜拆分條件

色譜柱為Chiralcel OD-H，流動相為30∶70∶0.1(v/v/v)的正己烷/乙醇/乙醇胺，流動相使用前超聲脫氣10 min。檢測器波長為254 nm;柱溫為25℃;流速為0.6 mL/min;進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3 對映體色譜分離性能評價(jià)參數(shù)

文中用于評價(jià)分離性能的參數(shù)如下:異構(gòu)體的保留因子k=(tR-t0)/t0，反映色譜柱對異構(gòu)體的保留特性;分離因子α=k2/k1，柱選擇性的量度;分離度Rs=2(t2-t1)/(w1+w2)，判斷異構(gòu)體在色譜柱中的分離情況;理論板數(shù)N=5.54(tR/Wh/2)2，定量表示色譜柱的分離效率;不對稱因子As=W0.05h/2a，描述色譜峰的不對稱程度。以上各式中，tR為保留時(shí)間，其中t1為弱保留化合物的保留時(shí)間，t2為強(qiáng)保留化合物的保留時(shí)間;t0為色譜柱的死時(shí)間;w1和w2為兩異構(gòu)體的峰寬;Wh/2為半峰高處的峰寬;W0.05h為5%峰高處的峰寬;a為峰極大至5%峰高處的前半峰寬。

1.4 溶解度測定方法

本文采用重量法［13］測定氨魯米特外消旋體在流動相中的溶解度。實(shí)驗(yàn)方法:首先用相同體積不同組成的流動相在玻璃瓶中溶解過量的氨魯米特粉末，將玻璃瓶放至30℃的水浴中恒溫12 h，得到飽和溶液。取500 μL飽和上清液至重量為mV的玻璃瓶中，稱重并記為mVS。將裝有上清液的玻璃瓶放至70℃的烘箱中進(jìn)行溶劑揮發(fā)，直至玻璃瓶重量不再發(fā)生變化，此時(shí)玻璃瓶重量記為mVR。氨魯米特外消旋體在溶劑中的飽和溶解度S(g/kg)可按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 氨魯米特在流動相中的溶解度

本實(shí)驗(yàn)所使用的固定相為涂敷型手性固定相，根據(jù)該類手性固定相使用說明書，本文選擇正己烷/乙醇、正己烷/異丙醇作為流動相，測定了氨魯米特外消旋體在這兩種流動相體系中的溶解度，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，當(dāng)醇含量為0即流動相為100%正己烷時(shí)，氨魯米特溶解度為0，說明氨魯米特不溶于正己烷。隨著流動相中醇含量的增加，氨魯米特的溶解度不斷增大。比較30℃時(shí)兩種流動相體系對樣品的溶解度可發(fā)現(xiàn)，在醇含量相同的情況下，氨魯米特在正己烷/乙醇中的溶解度高于氨魯米特在正己烷/異丙醇中的溶解度，并且隨著醇含量增加，兩者差值加大;至醇含量達(dá)到100%時(shí)，氨魯米特在乙醇中的溶解度(39.84 g/kg)是異丙醇(14.86 g/kg)的近3倍。在單一對映體制備過程中，樣品在流動相中的溶解度是關(guān)鍵因素，它關(guān)系著制備分離的生產(chǎn)量。本文所選用的正己烷、乙醇、異丙醇對氨魯米特的溶解度偏低，即使乙醇溶解度較好，在30℃條件下的最大溶解度值也僅為39.84 g/kg，因此在后續(xù)研究過程中，進(jìn)一步優(yōu)化溶劑種類以提高氨魯米特的溶解度是非常重要的。

本文通過Eviews 6.0軟件，采用普通最小二乘法基于截面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析.首先，對浙江省對外直接投資的出口效應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)，回歸結(jié)果如下：

圖2 氨魯米特外消旋體在兩種流動相體系中的溶解度Fig.2 Solubility of racemic aminoglutethimide in the two different solvents

此外，以正己烷/乙醇為流動相，還考察了溫度對氨魯米特溶解度的影響，結(jié)果如圖2所示。可以看出，溫度越高，氨魯米特在正己烷/乙醇中的溶解度越大，這一現(xiàn)象隨著乙醇含量的增加越發(fā)明顯。可見選擇高溫操作和高醇含量流動相更有利于樣品的溶解。然而，由于操作溫度以及流動相中醇含量均影響對映體在固定相上的吸附和分離，因此，本文將綜合考慮這些因素，選擇合適的操作溫度和流動相中的乙醇含量。

2.2 流動相添加劑對氨魯米特拆分的影響

流動相添加劑一般用來調(diào)整溶質(zhì)保留時(shí)間或改善色譜峰形，它的另一個重要作用是調(diào)節(jié)體系的pH值，從而建立穩(wěn)定的溶質(zhì)-固定相作用環(huán)境［14］。本文以正己烷/乙醇(30∶70，v/v)為流動相，乙醇胺為流動相添加劑，比較了不加乙醇胺和添加0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙醇胺兩種流動相組成下氨魯米特對映體的拆分效果，色譜圖見圖3。色譜分離后的樣品通過旋光儀(IBZ，德國)測定旋光度，結(jié)果證明 S-(-)-氨魯米特先出峰，R-(+)-氨魯米特后出峰，出峰順序與文獻(xiàn)［8］一致。從圖3可看出，當(dāng)流動相中不添加乙醇胺時(shí)，色譜峰形較差，主峰前面出現(xiàn)了一個較大的雜峰，推測這是由于固定相表面殘余硅羥基對溶質(zhì)的非立體選擇性吸附引起的。當(dāng)流動相中添加了0.1%乙醇胺時(shí)，主峰前的雜峰不再存在，主峰的峰形較不添加乙醇胺時(shí)更為“尖銳”，分離效果得到明顯改善。此外，觀察保留時(shí)間可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相中加有0.1%的乙醇胺時(shí)，兩異構(gòu)體的保留時(shí)間均變小，這可能是由于添加劑與溶質(zhì)在固定相的吸附位點(diǎn)上發(fā)生了競爭性吸附，從而影響了溶質(zhì)的保留時(shí)間。

圖3 流動相添加劑對氨魯米特手性拆分的影響Fig.3 Effect of mobile phase additive on the enantioseparation of aminoglutethimide

2.3 流動相中醇含量對氨魯米特拆分的影響

以正己烷/乙醇添加0.1%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇胺為流動相，在25℃下研究了不同醇含量對氨魯米特對映體拆分的影響，色譜柱的死時(shí)間t0由不保留物質(zhì)TTBB測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 流動相中乙醇含量對氨魯米特對映體拆分的影響Table 1 Effect of the ethanol content in mobile phase on the enantioseparation of aminoglutethimide

由表1可知，隨著流動相中乙醇含量的增加，即流動相的極性越來越大時(shí)，氨魯米特對映體的保留時(shí)間、保留因子、選擇性因子和分離度均越來越小?？赡苡?點(diǎn)原因:第一，隨著流動相中乙醇含量的增加，流動相的極性變大，不利于氨魯米特在固定相上的吸附，因此對映體更容易被洗脫下來，保留時(shí)間變的更短;第二，乙醇與固定相之間的氫鍵作用抑制了氨魯米特對映體與固定相間的作用，流動相中乙醇含量的增大引起保留時(shí)間縮短，分離度也變小;第三，隨著乙醇含量的增加，對映體與手性固定相上的識別可能也受到抑制，從而導(dǎo)致分離因子的下降。

從制備角度出發(fā)，在保證得到較好分離度的情況下，應(yīng)采用對樣品溶解度較大的流動相［15］，即醇含量高的流動相。同時(shí)，必須考慮到乙醇黏度較大，乙醇含量太高會造成系統(tǒng)壓力過高，特別是對多柱串聯(lián)的模擬移動床色譜而言，過高的系統(tǒng)壓力會對設(shè)備提出更高的要求。因此本文最終確定的流動相組成是正己烷/乙醇/乙醇胺體積比為30∶70∶0.1。

2.4 柱溫對氨魯米特拆分的影響

本文以Chiralcel OD-H手性柱為固定相，正己烷/乙醇/乙醇胺(30∶70∶0.1，v/v/v)為流動相，流速為0.6 mL/min，研究了25～40℃范圍內(nèi)溫度對氨魯米特拆分的影響，結(jié)果見表2。

從表2可知，隨著溫度的升高，保留時(shí)間、分離度明顯下降，分離因子變化很小，說明溫度對對映體選擇性的影響很小。通常在低溫條件下，對映體與手性固定相形成的配合物較高溫條件時(shí)更加穩(wěn)定，更不易被洗脫下來，有利于保留和提高分離因子，但也有文獻(xiàn)報(bào)道了分離因子隨柱溫升高而升高或基本保持不變的，這主要跟固定相的種類有關(guān)［16，17］。理論板數(shù)隨溫度升高而增加，這是因?yàn)樯郎赜欣跀U(kuò)散傳質(zhì)，從而提高色譜柱柱效。結(jié)合溶解度實(shí)驗(yàn)和柱溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，溫度升高雖有利于樣品的溶解，但不利于對映體在固定相上的吸附和分離，而且工業(yè)生產(chǎn)中在較高溫度下操作勢必會增加能耗，增加生產(chǎn)成本。因此，本文選擇25℃為合適的操作溫度。

表2 柱溫對氨魯米特對映體拆分的影響Table 2 Effect of column temperature on the enantiomeric separation

綜上所述，本文確定的最佳拆分條件是Chiralcel OD-H 為固定相，30∶70∶0.1(v/v/v)的正己烷/乙醇/乙醇胺為流動相，柱溫25℃。在0.6 mL/min的流速下拆分氨魯米特對映體，分離因子為1.43，分離度可達(dá)2.94，理論板數(shù)超過4 000。與前言報(bào)道的文獻(xiàn)相比，Ali等［7］在Chiralpak IA柱中實(shí)現(xiàn)了氨魯米特的拆分，選用的3組流動相的分離因子(3.52，2.32，1.88)較本文更高;Aboul-Enein 等［8］采用的分離體系的分離因子(1.43)雖與本文相近，但異構(gòu)體保留時(shí)間長達(dá)為16.02 min和20.46 min，不利于分析和制備，且采用的流動相中醇含量為50%，樣品在流動相中的溶解度偏低;文獻(xiàn)［9］選用的分離體系對氨魯米特對映體的分離度僅為0.68，不能實(shí)現(xiàn)氨魯米特的拆分。因此，本研究采用的方法具有簡便、快速、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)從制備角度優(yōu)選了流動相組成，為制備分離提供了參考數(shù)據(jù)。

2.5 進(jìn)樣量對氨魯米特拆分的影響

本文在上述最佳色譜條件下，又研究了進(jìn)樣濃度對對映體拆分的影響。根據(jù)樣品在流動相中的溶解度，本研究選用的氨魯米特外消旋體質(zhì)量濃度分別為 2.00、4.90和 10.30 g/L，進(jìn)樣體積均為 20 μL，得到的手性拆分色譜圖如圖4所示，相關(guān)色譜參數(shù)見表3。

從表3可看出，隨著進(jìn)樣濃度的增大，兩異構(gòu)體的保留時(shí)間均減小，說明氨魯米特對映體在固定相上的吸附行為可用非線性等溫線來描述。分離度和理論板數(shù)隨進(jìn)樣濃度增大均減小，這是由于隨著濃度增大，對映體不僅與流動相和固定相表面分子相互作用，同時(shí)與另一對映體之間還發(fā)生相互作用，從而影響了分離度和分離效率。而分離因子并未隨進(jìn)樣濃度增大發(fā)生改變，且數(shù)值均較大，說明選擇性高，本文優(yōu)選的分離體系適合用于拆分氨魯米特對映體。對映體色譜峰的不對稱因子隨濃度增大而增大，說明體系在濃度越高的條件下非線性越強(qiáng)，此時(shí)，溶液中兩對映體之間的相互作用不能忽略，有時(shí)甚至?xí)蔀橛绊懓濒斆滋夭鸱值闹饕蛩亍?/p>

圖4 不同進(jìn)樣濃度下氨魯米特的手性分離色譜圖Fig.4 Enantioseparation chromatograms of aminoglutethimide at different injection concentrations

表3 進(jìn)樣濃度對氨魯米特手性拆分的影響Table 3 Effect of injection concentration on enantioseparation of aminoglutethimide

對于制備分離，色譜柱的最大負(fù)載量是提高生產(chǎn)能力的重要參數(shù)，它與進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積有關(guān)，由溶質(zhì)在固定相上的吸附平衡決定。本工作在氨魯米特溶解度允許范圍內(nèi)，選取高進(jìn)樣濃度，總進(jìn)樣質(zhì)量濃度為10.42 g/L，在最佳拆分條件下研究了進(jìn)樣體積對對映體分離的影響，得到的色譜圖如圖5所示，相關(guān)色譜分離結(jié)果見表4。

表4 進(jìn)樣體積對氨魯米特色譜拆分的影響Table 4 Effect of injection volume on enantioseparationof aminoglutethimide

從表4可以看出，隨著進(jìn)樣體積的不斷增大，氨魯米特對映體的分離度不斷減小，對映體色譜峰發(fā)生展寬(見圖5)。而進(jìn)樣體積對分離因子的影響較小，分離因子基本不變，說明進(jìn)樣量對選擇性影響很小。當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL時(shí)，分離度為1.58，滿足基線分離的要求。加大進(jìn)樣體積至200 μL，分離度下降至1.13，繼續(xù)增大進(jìn)樣體積將不能實(shí)現(xiàn)對映體的分離。

3 結(jié)語

圖5 不同進(jìn)樣體積下氨魯米特的手性分離色譜圖Fig.5 Enantioseparation chromatograms of aminoglutethimide at different injection volumes

以纖維素-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)為固定相，正己烷/乙醇/乙醇胺為流動相，在高效液相色譜中實(shí)現(xiàn)了氨魯米特對映體的拆分，拆分效果良好。通過實(shí)驗(yàn)確定的最佳拆分條件如下:流動相為正己烷/乙醇/乙醇胺(體積比為 30∶70∶0.1)，柱溫為 25℃，流速為0.6 mL/min，分離度可達(dá)2.94，理論板數(shù)超過4 000。研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度進(jìn)樣條件下，氨魯米特在固定相上的吸附行為呈非線性，這在制備分離中可能成為影響氨魯米特拆分的主要因素。因此，進(jìn)一步測定高濃度的非線性吸附平衡具有重要意義。本研究所得結(jié)果可為工業(yè)化放大提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］ Elbashir A A，Suliman F E O，Saad B，et al.Talanta，2009，77(4):1388

［2］ Lu D Q，Li Y L，Ling X Q，et al.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research(盧定強(qiáng)，李衍亮，凌岫泉，等.時(shí)珍國醫(yī)國藥)，2009，20(7):1731

［3］ Huang B，Yang L R，Wu J P.Chemical Industry and Engineering Progress(黃蓓，楊立榮，吳堅(jiān)平.化工進(jìn)展)，2002，21(6):375

［4］ Wang M.Chinese Journal of Chromatography(王敏.色譜)，2014，32(2):198

［5］ Wang L P，F(xiàn)an H J，Wu K H，et al.Chinese Journal of Chromatography(王李平，范華均，巫坤宏，等.色譜)，2012，30(12):1265

［6］ Lee E，Park M B，Kim J M，et al.Korean J Chem Eng，2010，27(1):231

［7］ Ali I，Naim L，Ghanem A，et al.Talanta，2006，69(4):1013

［8］ Aboul-Enein H Y，Serignese V.Chirality，1994，6(5):378

［9］ Aboul-Enein H Y，Serignese V.Chirality，1998，10(4):358

［10］ Gong R，Li P，Yu J G.J Chromatogr A，2013，1286:119

［11］ Mao S，Zhang Y，Rohani S，et al.J Sep Sci，2012，35(17):2273

［12］ Du X，Wang Q，He X.Chemical Reagents(杜曦，王欽，何曉.化學(xué)試劑)，2011，33(7):652

［13］ Ribeiro A E，Graca N S，Pais L S，et al.Sep Pur Technol，2008，61(3):375

［14］ Arnell R，F(xiàn)orssén P，F(xiàn)ornstedt T，et al.J Chromatogr A，2009，1216(16):3480

［15］ Patil N S，Mendhe R B，Sankar A A，et al.J Chromatogr A，2008，1177(2):234

［16］ Kusters E，Spondlin C.J Chromatogr A，1996，737(2):333

［17］ Ellington J J，Evans J J，Prickett K B，et al.J Chromatogr A，2001，928(2):145