勾新磊， 高 峽，2*， 胡光輝， 劉偉麗，2

(1.北京市理化分析測試中心，北京100089;2.國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094)

抑郁癥是一種常見的心理障礙，臨床表現(xiàn)為持續(xù)悲觀、心情低落、思維遲緩，部分患者會伴有狂躁、焦慮、失眠等癥狀［1，2］，市場上一些中成藥及保健品可以治療或緩解這些癥狀。一些商販在利益驅(qū)動下向其中非法添加抗抑郁藥物成分以增強療效，患者長期使用會產(chǎn)生藥物依賴，使用不當會危害身體健康，甚至危及生命［3］。因此建立中成藥和保健品中抗抑郁藥物的檢測方法，對打擊制假販假行為、保護人民身體健康具有重要意義。

目前，中成藥和保健品中精神類藥物的檢測方法有薄層色譜法(TLC)［4］、液相色譜法(LC)［5］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)［6-8］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［9-17］等。但 TLC檢測結果假陽性率高;LC靈敏度較低;GC-MS雖然靈敏度高，但是部分藥物需要進行繁瑣費時的衍生化前處理;而LC-MS/MS方法因具有靈敏度高、檢出限低的特點，可以進行多組分定性、定量檢測，是目前報道較多的方法?，F(xiàn)有文獻［9，10］主要針對苯二氮類、巴比妥類等鎮(zhèn)靜安神類藥物進行檢測，而對于中成藥和保健品中添加的能緩解煩躁、焦慮等癥狀的抗抑郁藥物的檢測，目前還未見報道。本文建立了同時檢測中成藥和保健品中9種抗抑郁藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法。該方法準確、簡便、快速，為中成藥和保健品中抗抑郁藥物的檢測及監(jiān)控提供了科學依據(jù)和技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity超高效液相色譜儀，Xevo TQ串聯(lián)質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1工作站(美國 Waters公司);KQ6000V超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);CR22GⅢ離心機(日本日立公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

西酞普蘭、多塞平、帕羅西汀、氟伏沙明、馬普替林、阿米替林、氟西汀、舍曲林、氯米帕明(純度均≥97%，中國藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈、正己烷為色譜純(美國Fisher公司);二氯甲烷、丙酮為色譜純(安徽時聯(lián)公司);實驗用水為經(jīng)Milli-Q超純水器過濾的去離子水;其他試劑均為分析純。樣品隨機購自藥店及超市。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取適量上述標準物質(zhì)，置于不同容量瓶中，用甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的單標準儲備液。準確移取各單標準儲備液0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg/L的混合對照品儲備液。所有標準溶液均在4℃下保存。

1.3 樣品處理

稱取1.0 g樣品(片劑碾碎，膠囊去殼研細)，置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL甲醇，超聲提取20 min，以10 000 r/min的速率離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾后，用 UPLCMS/MS檢測。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm;美國 Waters公司);流動相:A為0.1%(v/v，下同)甲酸水溶液，B為乙腈;流速:0.2 mL/min;柱溫:35℃;梯度洗脫程序:0～1.0 min，20%B;1.0～7.0 min，20%B ～70%B;7.0～8.0 min，70%B;8.0～8.5 min，70%B ～20%B;8.5～10.0 min，20%B。

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:3.0 kV;萃取電壓:5.0 V;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流速:650 L/h;錐孔氣流速:20 L/h。其他具體實驗參數(shù)見表1。

表19 種抗抑郁藥物的UPLC-MS/MS參數(shù)和保留時間Table 1 UPLC-MS/MS parameters and retention times for the nine antidepressants

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇及裂解規(guī)律的研究

在ESI模式下，使用蠕動泵以5 μL/min的速度依次將9種抗抑郁藥物的單標準溶液分別注入質(zhì)譜的離子源中，測定其在正離子(ESI+)、負離子(ESI-)模式下的質(zhì)譜信號強度。實驗結果表明，在ESI+模式下，9種抗抑郁藥物均可獲得較高豐度的［M+H］+準分子離子峰。依據(jù)食品法典委員會和歐盟第2002/657/EC號［18］文件的有關規(guī)定，選擇2對離子進行MRM監(jiān)測。確定母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，對子離子進行優(yōu)化選擇，以確定定量離子和定性離子。然后根據(jù)選擇的子離子對離子源溫度、脫溶劑氣溫度及流量和錐孔氣流量進行優(yōu)化，使目標物質(zhì)的離子化效率達到最佳。9種抗抑郁藥物定量離子的裂解規(guī)律見圖1。

圖1 9種抗抑郁藥物定量離子的裂解途徑Fig.1 Fragmentation pathways of quantitative ions of the nine antidepressants

2.2 色譜條件的選擇

實驗采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18分離柱，分別比較了甲醇和乙腈作為有機相，水、0.1%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨作為水相的分離效果。實驗表明:使用甲醇為有機相，目標物保留時間相對較長;乙酸銨作為水相，目標物質(zhì)響應差;乙腈-0.1%甲酸水作為流動相效果最好。在流動相中加入0.1%甲酸水，有助于化合物的離子化，使目標物響應增大，提高靈敏度。采用梯度洗脫，可提高抗抑郁藥物各組分在色譜柱中的分離效率。

圖2為9種抗抑郁藥物(質(zhì)量濃度為10 μg/L)的總離子流圖。

圖2 9種抗抑郁藥物(10 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of the nine antidepressants(10 μg/L)

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

本文分別考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷作為提取溶劑時各個目標化合物的提取效果，結果見表2。

表2 不同提取溶劑的提取效果對比Table 2 Comparison of the extraction results by different extraction agents %

由表2可以看出，使用甲醇作為提取溶劑時，9種抗抑郁藥物的提取效率最佳，且超聲提取后快速離心，操作方便，簡化了樣品前處理過程。

2.4 方法的線性關系和檢出限

以空白片劑樣品的提取液作為標準溶液的稀釋溶液，精確配制0.04～20 μg/L范圍內(nèi)的一系列不同濃度的混合標準工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定。分別以各分析物的峰面積(Y)和對應的質(zhì)量濃度(X，μg/L)進行線性回歸計算，得到線性回歸方程和線性相關系數(shù)(R2)。以特征離子色譜峰的S/N≥3為標準確定方法的檢出限，以S/N≥10為標準確定方法的定量限，結果如表3所示。9種抗抑郁藥物在0.04～20 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.998，檢出限為 0.006 8 ～0.034 μg/L，說明本方法適用于中成藥和保健品中9種抗抑郁藥物的定量分析。

表3 9種抗抑郁藥物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficients(R2)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of the nine antidepressants

2.5 加標回收率和精密度

以空白中成藥膠囊和片劑保健品為樣品，分別添加0.5、1、5 μg/L 3個濃度的混合標準溶液，進行添加回收率和精密度實驗，每個濃度水平平行測定6次。結果如表4所示，在3個濃度水平下，各待測物的平均回收率為77.7%～100.8%，相對標準偏差為0.9%～9.1%，能滿足中成藥和保健品中9種抗抑郁藥物的測定要求。

2.6 樣品分析

利用本方法分別對市售的康富麗牌褪黑素軟膠囊(廣州三九科工貿(mào)實業(yè)發(fā)展公司，批號為20120210)、清華紫光褪黑素片(威海生原藥業(yè)有限公司，批號為12021501)、解郁安神膠囊(吉林百姓堂藥業(yè)有限公司，批號為20120904)、蒲郁膠囊(四川諾迪康威光制藥有限公司，批號為130102)和舒神靈膠囊(長春海外制藥集團有限公司，批號為20110201)進行了檢測，所有樣品中均未檢出上述9種抗抑郁藥物。

表4 9種抗抑郁藥物在3個加標水平下的平均回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of the nine antidepressants at three spiked levels(n=6)

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定中成藥和保健品中9種抗抑郁藥物的分析方法。該方法準確、簡便、快速，可用于中成藥和保健品中抗抑郁藥物的實際檢測。

［1］ Zhang H，Wang D X.China Journal of Modern Medicine(章虹，汪道鑫.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志)，2010，20(9):1342

［2］ Gao S.China Journal of Modern Medicine(高山.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志)，2012，22(33):83

［3］ Hao J，Liu J.Chinese Pharmaceutical Journal(郝杰，柳潔.中國藥學雜志)，2013，48(11):934

［4］ Xiao L H，Liu J J，Guan X Y，et al.China Modern Medicine(肖麗和，劉吉金，關瀟瀅，等.中國當代醫(yī)藥)，2009，16(14):15

［5］ Fernández P，González C，Pena M T，et al.Anal Chim Acta，2013，767:88

［6］ Wu H Q，Jin Y C，Cai M Z，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(吳惠勤，金永春，蔡明招，等.分析化學)，2007，35(4):500

［7］ Liu J J，Xiao L H，Guan X Y，et al.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(劉吉金，肖麗和，關瀟瀅.等.藥物分析雜志)，2011，31(2):376

［8］ Cartiser N，Bévalot F，Le Meur C，et al.J Chromatogr B，2011，879(27):2909

［9］ Zhu L，Ruan L P，Liu H L，et al.Chinese Journal of Chromatography(朱琳，阮麗萍，劉華良.色譜)，2013，31(7):709

［10］ Yan A H，Li X L，Xi C X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(嚴愛花，李賢良，郗存顯，等.分析化學)，2013，41(4):509

［11］ Wang J W，Huang X L，Cao J，et al.Chinese Journal of Chromatography(王靜文，黃湘鷺，曹進，等.色譜)，2014，32(2):151

［12］ Yan L J，Zhang F，Wu M，et al.Journal of Instrumental Analysis(嚴麗娟，張峰，吳敏，等.分析測試學報)，2011，30(11):1301

［13］ Li B，Liu W，F(xiàn)an S，et al.Chinese Journal of Chromatography(李兵，劉偉，范賽，等.色譜)，2012，30(6):584

［14］ Ming D S，Heathcotea J.J Chromatogr B，2011，879(5/6):421

［15］ Choong E，Rudaz S，Kottelat A，et al.J Chromatogr B，2011，879(19):1544

［16］ Chambers E E，Woodcock M J，Wheaton J P.J Pharmaceut Biomed，2014，88:660

［17］ Amundsen I，?iestad ? M L，Ekeberg D，et al.J Chromatogr B，2013，927:112

［18］ European Commission Decision 2002/657/EC