張秀堯， 蔡欣欣

（溫州市疾病預防控制中心，浙江 溫州325001）

β－內(nèi)酰胺類抗生素主要有青霉素類和頭孢菌素類，是目前治療奶牛乳腺炎的首選藥物，為牛奶中最為常見的抗生素殘留之一。經(jīng)常飲用含有抗生素殘留的牛奶可引起敏感人群過敏，還會誘導產(chǎn)生耐藥菌株，給人類健康帶來潛在的危害。青霉素類抗生素在生物體內(nèi)代謝，或在β－內(nèi)酰胺酶的作用下內(nèi)酰胺環(huán)打開生成各自的青霉噻唑酸（penicilloic acid），氨芐西林和阿莫西林還可產(chǎn)生氨芐西林哌嗪－2′，5′－二酮（ampicillin piperazine－2′，5′－dione）和阿莫西林哌 嗪－2′，5′－二 酮 （amoxicillin piperazine－2′，5′－dione）（見圖1）。這些分解產(chǎn)物是青霉素類藥物引起過敏反應的主要成分［1］，在牛奶加工生產(chǎn)過程中青霉素類抗生素也會分解產(chǎn)生這些化合物［2］，已有使用一些生物制劑如β－內(nèi)酰胺酶等分解牛奶中殘留的抗生素生產(chǎn)人造“無抗奶”的現(xiàn)象［3，4］。目前牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法大都是測定原藥殘留［5－9］，這些方法不能測定青霉素類藥物的代謝產(chǎn)物，有一定的局限性。

有文獻［10－12］報道利用LC－MS／MS測定動物組織中阿莫西林及其主要代謝產(chǎn)物阿莫西林青霉噻唑酸（amoxycilloic acid）和阿莫西林哌嗪－2′，5′－二酮，以及測定牛奶和奶粉中4種青霉素及其β－內(nèi)酰胺酶酶解產(chǎn)物（青霉素G脫羧噻唑酸、青霉素V脫羧噻唑酸、阿莫西林脫羧噻唑酸、氨芐西林脫羧噻唑酸）的殘留。但系統(tǒng)地檢測牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素原藥及其代謝產(chǎn)物的殘留還未見報道?；谏鲜鲈颍覀兘⒘丝焖贆z測牛奶中53種β－內(nèi)酰胺類抗生素及其代謝產(chǎn)物殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，方法簡單、快速、靈敏，應用于實際樣品的監(jiān)測，取得了滿意的結(jié)果。

圖1 青霉素類酶解反應Fig.1 Enzymic hydrolysis reaction of penicillins

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC－Quattro Premier XE超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1工作站（美國Waters公司）；MR32i大容量高速冷凍離心機（法國Jouan公司）；TGL－16C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；N－EVAP氮吹儀（12孔，美國Organomation公司）；2510超聲波清洗機（美國Branson公司）；10 mL聚全氟乙丙烯（FEP）圓底旋蓋離心管（美國 Nalgene公司）；Amicon Ultra－0.5 mL離心超濾管，截止相對分子質(zhì)量3 kDa（法國Millipore公司）；Gradient A10 Mill－Q超純水器（法國Millipore公司）；Distriman連續(xù)加液器（125μL～12.5 mL，法國Gilson公司）。

乙腈為HPLC級（德國 Merck公司）；甲酸為HPLC級（美國 Tedia公司）；β－內(nèi)酰胺酶I（TEM1，1.0×107u／瓶，杭州北望生物技術(shù)有限公司）

雙氯西林鈉鹽（98%（純度，下同））、氨芐西林（99.5%）、氯 唑 西 林 （98.5%）、苯 唑 西 林 鈉 鹽（98.0%）、阿莫西林（98.5%）、美西林（90.0%）、頭孢喹肟（95.0%）、頭孢匹羅（97.0%）、乙氧萘西林鈉鹽（93.0%）和頭孢噻呋（86.0%）標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲氧西林鈉鹽（≥85%）、阿撲西林（97.2%）、青霉素 G鉀鹽（99.8%）和青霉素V鉀鹽（99.8%）標準品購自Sigma公司；替卡西林購自英國Apolloscientific公司；頭孢匹林（93.3%）為美國藥典標準物質(zhì)；阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、氟 氯 西 林、頭 孢 氨 芐 （94.2%）、頭 孢 哌 酮（96.5%）、頭孢唑啉（99.3%）、頭孢拉定（91.8%）、頭孢羥氨芐（95.0%）、頭孢曲松（84.1%）、頭孢克洛（93.2%）、頭孢他啶（84.2%）、頭孢地尼（98.3%）、頭孢克肟（85.4%）、頭孢米諾（77.4%）、頭孢替唑（90.0%）、頭孢地嗪（88.6%）、頭孢硫脒（95.7%）、頭孢吡肟（83.0%）和美羅培南（87.2%）均為化學對照品，購自中國生物制品檢定所。以上標準物質(zhì)分別用乙腈－水（1∶1，如無特殊說明均為體積比）配制成1.0 g／L標準貯備溶液；然后將20種頭孢菌素類配制成混合標準貯備液（50 mg／L），將17種青霉素類稀釋成混合標準貯備液（50 mg／L）。

磺胺甲噁唑－d4，購自Toronto Research Chemicals Inc.公司，用乙腈配制成1.0 g／L標準貯備溶液，再稀釋成1.0 mg／L的內(nèi)標使用液。

19種青霉素類酶解產(chǎn)物的制備：吸取500μL 17種青霉素類混合標準貯備液于10 mL具塞離心管中，40℃水浴中以氮氣吹去乙腈，再加水至1.0 mL，然后加入 30μLβ－內(nèi)酰胺酶 I（1.0×107u／mL），室溫振蕩反應40 min，加入乙腈至5 mL，混勻，即為青霉素類酶解產(chǎn)物的標準貯備溶液。此標準溶液含有17種青霉噻唑酸、氨芐西林哌嗪－2′，5′－二酮和阿莫西林哌嗪－2′，5′－二酮，氨芐西林噻唑酸和氨 芐西林哌 嗪－2′，5′－二 酮 質(zhì) 量 濃 度 之 和 為 5 mg／L（以氨芐西林計），阿莫西林噻唑酸和阿莫西林哌嗪－2′，5′－二酮的質(zhì)量濃度之和也為5 mg／L（以阿莫西林計），其余15種青霉噻唑酸均為5 mg／L（以原藥計）。

臨用時將17種青霉素類、20種頭孢菌素類和19種青霉素類酶解產(chǎn)物的標準儲備液按適當?shù)谋壤旌系玫交旌蠘藴适褂靡?，各物質(zhì)終質(zhì)量濃度為2.0 mg／L。

1.2 樣品前處理方法

取2.00 g牛奶置于10 mL FEP圓底旋蓋離心管中，加入20μL 1.0 mg／L的內(nèi)標物，再加入2.0 mL乙腈并渦旋30 s，超聲5 min，然后以12 000 r／min離心5 min，取500μL上清液于超濾管中以14 000 r／min（14 875 g）離心10 min，超濾液于40℃下用氮氣吹至約100μL，加水100μL，旋渦混勻，以16 000 r／min離心5 min，上清液待測。

在6個各含2.00 g空白牛奶的離心管中分別按標準曲線的濃度加入適量混合標準使用液，混勻，放置30 min，加入20μL1.0 mg／L內(nèi)標液，與樣品一起處理，制作工作曲線。

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），VanGuard BEH C18保護柱（5 mm×2.1 mm，1.7μm）（美國 Waters公司）；流動相為0.1%甲酸水液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）。梯度洗脫程序：0～0.50 min，5%B；0.50～5.00 min，5%B～35%B；5.00～7.00 min，35%B～65%B；7.00～7.10 min，65%B～95%B；7.10～8.00 min，95%B；8.00～8.10 min，95%B～5%B；8.10～10.00 min，5%B。流速：0.400 mL／min；柱溫：45℃；樣品室溫度：5℃；進樣體積：10μL。

電噴霧離子源正離子多反應監(jiān)測（MRM）模式。ESI＋毛細管電壓：3.30 kV；離子源溫度：130℃；脫溶劑溫度：380℃；脫溶劑氣流量：750 L／h；錐孔反吹氣流量：50 L／h；碰撞室氬氣壓力：0.346 Pa。其他質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

運行開始時，色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液中直到1.10 min，質(zhì)譜從1.10 min開始采集數(shù)據(jù)至7.30 min結(jié)束，同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準溶液的制備

試驗發(fā)現(xiàn)青霉素類標準物質(zhì)若用甲醇配制會很快反應生成各自的青霉噻唑酸甲酯；頭孢菌素類用甲醇配制即使在－20℃下保存，穩(wěn)定期也只有數(shù)周。故所有標準物質(zhì)均采用乙腈或乙腈－水混合液配制，－20℃下保存。此條件下至少可穩(wěn)定儲存6個月。

青霉素類藥物青霉噻唑酸未見標準物質(zhì)出售，只得用β－內(nèi)酰胺酶酶解制備，酶解反應時間由UPLC－MS／MS分析至原藥色譜峰完全消失來確定。在本試驗條件下，40 min酶解反應完全，此時各青霉噻唑酸為單個色譜峰；隨著酶解時間延長青霉噻唑酸會在5位消旋化成一對手性異構(gòu)體，在色譜上表現(xiàn)為兩個相近的色譜峰［13，14］。阿莫西林和氨芐西林酶解時除生成噻唑酸外，還會生成各自的哌嗪－2′，5′－二酮。酶解反應完全后加入高比例的乙腈使β－內(nèi)酰胺酶變性失活，從而終止反應。

分離制備了青霉素類藥物的β－內(nèi)酰胺酶酶解產(chǎn)物，但制備得到的酶解產(chǎn)物配制成溶液后非常不穩(wěn)定，保存期很短。故采用17種青霉素類混合標準貯備液臨用時酶解制備19種青霉素類酶解產(chǎn)物的標準溶液。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

原藥溶液（2.0 mg／L）直接用注射泵進樣優(yōu)化；酶解產(chǎn)物則先將單個原藥酶解，用乙腈稀釋成2.0mg／L，再用注射泵進樣優(yōu)化。

表1 53種β－內(nèi)酰胺類抗生素的多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)、保留時間、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、加標回收率、相對標準偏差、最高允許限量、檢出限和定量限Table 1 MRM parameters，retention times，linearity ranges，correlation coefficients（r），spiked recoveries，relative standard deviations，maximum residue levels（MRLs），LODs and LOQs of the 53β－lactams

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

注射泵以50μL／min的流速將每種待測組分的標準溶液通過三通匯合一定比例的流動相注入離子源中，在正離子模式下得到準分子離子峰，再對準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到碎片離子信息，然后對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，使每種組分的準分子離子產(chǎn)生的特征碎片離子強度達到最大；然后標準溶液由UPLC進樣，再對離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等進行優(yōu)化。遵循國際慣例，確證分析需要4個識別點，選擇兩對離子對，其中干擾小、信噪比大的離子對作為定量離子對。設(shè)定合適的峰駐留時間（dwell time）確保色譜峰的采樣點數(shù)在12～20點，從而得到較好的定量重復性。由于美西林噻唑酸和替卡西林噻唑酸的靈敏度比較低，美洛西林經(jīng)樣品前處理后回收率不好而使標準曲線不呈線性，因此這3種化合物不予測定。優(yōu)化后的測定條件見表1。

圖2 牛奶基質(zhì)中53種β－內(nèi)酰胺類抗生素（10μg／L）標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of a milk matrix standard solution of the 53β－lactams（10μg／L）Peak numbers are the same as in Table 1.

2.3 色譜條件的優(yōu)化

以 ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）作為分析柱，分別采用不同濃度的甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇溶液作為流動相進行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)使用0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸甲醇溶液都能得到較高的靈敏度和較好的分離效果。由于乙腈的柱壓較低、洗脫能力較強，最終選用的流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液。同時選擇適當?shù)奶荻认疵摮绦蚴?3種待測組分得到較好的分離，一次分析僅需10 min。為了防止待測物在液相色譜進樣前分解，將樣品室的溫度設(shè)為5℃。53種待測物的總離子流色譜圖見圖2。

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素的樣品前處理方法主要有乙腈沉淀去除蛋白質(zhì)的方法［6，9，15］和反相固相萃取法［5，7，8］。采用乙腈沉淀法，處理液中雜質(zhì)較多，測定時有基質(zhì)抑制效應；而使用反相固相萃取法后有基質(zhì)抑制效應，與乙腈沉淀法相比并無明顯改善。本試驗采用乙腈沉淀法，并增加超聲提取步驟，提取液最終經(jīng)過超濾凈化結(jié)合液相色譜在線流路切換，利用切換閥將色譜柱開始流出的含強極性成分的雜質(zhì)切換至廢液中，質(zhì)譜只對待測成分流出部分進行檢測，最后將乙腈洗脫的弱極性雜質(zhì)切換到廢液中，避免質(zhì)譜受到污染。

在2.00 g牛奶樣品中分別加入等體積和2倍體積的乙腈提取，結(jié)果表明加入等量乙腈時的回收率要優(yōu)于2倍量乙腈時的回收率。可能是加入2倍量的乙腈使蛋白質(zhì)迅速沉淀，待測物被包裹在沉淀物中而難于完全提取出來。牛奶樣品加入等量的乙腈混勻后不會出現(xiàn)沉淀，經(jīng)高速離心可去除大部分雜質(zhì)，上清液基本澄清，再經(jīng)超濾去除大分子物質(zhì)，可顯著降低基質(zhì)效應。由于超濾管有一定死體積，500μL乙腈提取液經(jīng)超濾得到約400μL超濾液。經(jīng)氮吹去除乙腈至體積約為100μL，基本去除乙腈，避免早出峰組分的峰形變寬，加入100μL水使處理液總體積約為200μL，不需定容。為了校正樣品中可能存在的基質(zhì)效應、處理液最終體積的偏差以及樣品前處理過程中的損失，采用基質(zhì)工作曲線內(nèi)標法定量。前處理方法簡單、快速，每人每天可處理50多份樣品。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉素G－d7作為同位素內(nèi)標加在含有β－內(nèi)酰胺酶的樣品中會被分解，最終無法定量計算。經(jīng)過試驗最終選用磺胺甲噁唑－d4作為內(nèi)標物。

2.5 線性范圍和檢出限

在空白樣品中加入標準溶液，制作6點系列標準工作溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行測定。采用Masslynx 4.1中Targetlynx組件以定量離子對峰面積和內(nèi)標物定量離子對峰面積的比值對基質(zhì)標準溶液的質(zhì)量濃度作圖，牛奶中53種待測物的相關(guān)系數(shù)在0.991 1～0.999 0之間，符合線性關(guān)系的要求。在本法操作條件下，信噪比為3時對應的樣品質(zhì)量濃度為檢出限（LOD），信噪比為10時對應的樣品質(zhì)量濃度作為定量限（LOQ）（見表1），結(jié)果能夠滿足我國和歐盟對獸藥殘留最高限量的要求。

2.6 方法的回收率和精密度

用空白牛奶進行加標回收率和精密度實驗，樣品添加不同水平的標準溶液后，放置30 min，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再按優(yōu)化的樣品前處理方法進行操作，其回收率和精密度結(jié)果見表1。加標回收率均在71%～121%范圍內(nèi)，相對標準偏差在1.7%～19%之間，符合獸藥多殘留分析的要求。

2.7 實際樣品的檢測

對14份市售品牌牛奶進行檢測，共有3份樣品檢出β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留，其中1份樣品同時含有頭孢拉定和頭孢米諾，含量分別為5.6μg／kg和2.8μg／kg（見圖3），另外2份樣品均檢出氨芐西林，但其殘留量都低于定量限。

圖3 牛奶樣品中檢出的（a）頭孢米諾和（b）頭孢拉啶的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of（a）cefminox and（b）cefradine in milk samples

3 結(jié)論

通過對樣品提取、凈化以及色譜分離、質(zhì)譜測定等條件的優(yōu)化，建立了快速同時測定牛奶中53種β－內(nèi)酰胺類抗生素及其代謝產(chǎn)物多殘留的方法。該方法簡單、快速，每人每天可處理50多份樣品，且特異性強、靈敏度高，已應用于實際樣品的測定，取得了滿意的結(jié)果。

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