李瑞萍， 袁 琴， 黃應(yīng)平＊

（1.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心，三峽大學(xué)，湖北 宜昌443002；2.三峽地區(qū)地質(zhì)災(zāi)害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 宜昌443002）

親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）于1990年由Alpert命名［1］，是以親水固定相及含有60%以上非質(zhì)子有機溶劑（通常為乙腈）的水（至少2.5%）為流動相的色譜模式，為近年來色譜領(lǐng)域研究的熱點之一［2－4］。HILIC是取代正相色譜（NPLC）分離極性化合物的另一色譜模式［5］，與 NPLC相比具有如下優(yōu)點［5－8］：其一使用與反相色譜（RPLC）相似的儀器和流動相，與質(zhì)譜（MS）檢測器特別是電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI－MS）兼容，提高了檢測靈敏度［6－8］；其二 HILIC采用水及與水互溶的有機溶劑為流動相，不僅解決了NPLC重現(xiàn)性差［9］及極性物質(zhì)不溶于流動相的問題，同時克服了NPLC流動相與大多數(shù)RPLC洗脫劑不兼容，使得二維（2D）分離難以實施的缺點［5，10］。HIL－IC也是RPLC的補充，對極性化合物有合適的保留及選擇性。由于采用低黏度的高比例有機相流動相，HILIC對強極性化合物分離時具有比RPLC更好的分離性能（更低的理論塔板高度）［11，12］，而且與蛋白沉淀及固相萃取凈化提取后的洗脫溶劑兼容，樣品可以直接進樣分析［13，14］，實現(xiàn)了高通量快速分析，并提高了分析物的回收率，使樣品的檢出限更低。鑒于以上優(yōu)點，HILIC在生物分析中使用非常廣泛，近期在超高效液相色譜（UHPLC）中的應(yīng)用也日益增多［15－19］。

最近幾年，HILIC研究發(fā)展迅速，其應(yīng)用領(lǐng)域及分析物種類不斷拓展，相關(guān)HILIC研究和應(yīng)用綜述逐漸增多［3－6，11，20－35］。其中，HILIC 的固 定 相也 受到廣大學(xué)者及色譜柱生產(chǎn)廠家的極大關(guān)注，有很多新的固定相已商品化，目前用于HILIC模式分離的固定相已達50多種，而且這個數(shù)字仍在不斷增長［4，5，21，35］。在眾多固定相中，未鍵合硅膠作為第一代HILIC固定相應(yīng)用最廣，尤其是以硅膠為色譜柱的HILIC與MS聯(lián)用作為生物基質(zhì)中極性分子分析的重要技術(shù)已經(jīng)得到認可［5，22，30］。硅膠柱引起關(guān)注的另一原因是沒有配體，不會因為配體流失而在質(zhì)譜圖中出現(xiàn)多余的峰，而且由于其穩(wěn)定性高，可以在更寬的 pH 范圍內(nèi)使用［14，36］。此外，美國 EPA 1694方法中，采用以未鍵合硅膠為色譜柱的HILIC－MS／MS方法測定環(huán)境樣品中的藥物及個人護理品（PPCPs）［37，38］，這意味著伴隨著 HILIC 應(yīng)用研究的深入開展，HILIC技術(shù)也日益趨向穩(wěn)定和標準化［26］。硅膠柱廣泛用于分離極性小分子如藥物，而用于糖、肽或蛋白質(zhì)分離較少。本文總結(jié)了以未鍵合硅膠為色譜柱的HILIC保留機理，概述了操作條件如硅膠柱類型、流動相組成及柱溫對極性化合物保留的影響。

1 以未鍵合硅膠為色譜柱的HILIC保留機理

硅膠在色譜技術(shù)中應(yīng)用最廣，其在效率、硬度及性能方面均優(yōu)于其他填料［35］。硅膠填料分為A、B及 C3種類型［4，31，39］。A 型硅膠為最早的通用型色譜填料，通常被金屬污染，不適用于HILIC；B型硅膠為球形顆粒，金屬雜質(zhì)含量低，在中性到高pH（至少pH9）范圍內(nèi)相對穩(wěn)定；C型硅膠為“氫化硅膠”，與經(jīng)典的硅膠在化學(xué)結(jié)構(gòu)方面有很大不同，經(jīng)典硅膠表面主要為極性硅醇基（Si－OH），而C型硅膠表面主要為硅－氫（Si－H）基團，用“含水正相”（aqueous normal phase，ANP）描述在此類硅膠相上的分離，與“經(jīng)典的”HILIC分離區(qū)別，然而ANP通常被認為是替代HILIC的另一名詞［40］。C型硅膠極性較低，對水的吸附少，不僅改善了保留的重現(xiàn)性，而且為HILIC中弱極性化合物的分離提供了新的選擇性［5，9，41］。除了這些最初主要用于非水流動相中的硅膠外，其他專門用于水－有機流動相的硅膠材料具有較少的表面硅醇基，如Atlantis?HILIC Silica，是當前 HILIC 應(yīng)用中最常用的固定相［5，37，38，42－46］。也有核－殼表面多孔顆粒（Halo）［47］及未衍生的亞乙基橋雜化（BEH）顆粒［48－50］用于 HILIC分離的報道。商品化的硅膠填料在純度上有所不同，取決于制備技術(shù)。因此，不同廠家的硅膠柱在保留性能、柱效及峰形上有很大差異，但具有相似的選擇性［5，13］。

硅膠表面含有Si－OH 和硅氧烷（Si－O－Si）兩種基團。Si－OH 為強吸附點，而 Si－O－Si具有疏水性［5］。盡管HILIC概念于1990年提出，但早在20世紀80年代，這種以未鍵合硅膠為色譜柱，采用反相流動相的色譜模式已用于堿性化合物的分離，并提出該色譜模式下堿性化合物在硅膠柱上的保留存在離子交換機理［22，51－53］。以未鍵合硅膠為色譜柱的HILIC中分析物保留主要受兩種作用控制，（1）固定相表面富水層與疏水性更強的流動相之間的分配作用，（2）與固定相上薄層水之間的氫鍵作用。最近McCalley及Neue［54］采用高乙腈含量流動相，通過測定苯及甲苯的保留時間，證實了硅膠表面富水層的存在。HILIC的分離機理仍存在著爭議，目前普遍認為，在水－有機流動相中，溶質(zhì)在硅膠柱上的HILIC保留機理較復(fù)雜，包括分配作用、離子交換、氫鍵作用和靜電作用，甚至包括在低有機溶劑濃度時與Si－O－Si疏水作用的反相保留。后來一些學(xué)者也證實了HILIC模式下堿性化合物在硅膠柱上的復(fù)雜保留機 理［36，55，56］?？偟?來說，HILIC 保留 機 理主要取決于分析物的性質(zhì)、流動相組成及色譜柱特性［47，55］，這種復(fù)雜機理會導(dǎo)致相同固定相對不同溶質(zhì)的保留表現(xiàn)出較大差異［57，58］。

當前，HILIC保留機理仍是色譜界的研究熱點。一些作者通過考察不同性質(zhì)化合物在不同HILIC色譜柱上的保留行為，進一步揭示及確證HILIC保留機理。如McCalley［59］考察了中性、強酸性及強堿性化合物在硅膠、酰胺柱、二醇基柱及兩性離子柱上的保留行為，實驗數(shù)據(jù)證實HILIC機理非常復(fù)雜，包括分配、吸附、離子作用及疏水作用。當水含量較高時，對于大多數(shù)極性溶質(zhì)常觀察到logk與水相體積分數(shù)之間呈線性關(guān)系，但Jin及其合作者［60］考察了核苷在6種不同極性固定相包括3種硅膠柱（Atlantis HILIC silica，Venusil HILIC及BEH HILIC）及3種合成固定相上保留隨流動相中水含量的變化，腺苷無論用分配模型還是吸附模型在6根色譜柱上都不存在線性關(guān)系。他們提出了HILIC中描述極性溶質(zhì)保留行為的新方程式：

式中CB為流動相中水相體積分數(shù)。常數(shù)a與溶質(zhì)的分子體積相關(guān)，b與溶質(zhì)－固定相作用有關(guān)，c與溶質(zhì)及溶劑之間作用能有關(guān)。該模型說明了HILIC中溶質(zhì)保留是一個復(fù)雜工程，不完全是受一種機理控制（如分配或吸附），以哪一種機理為主則取決于溶質(zhì)的性質(zhì)、極性固定相性質(zhì)及流動相組成。

2 影響HILIC保留的主要因素

HILIC保留行為受到多種參數(shù)的影響，除了固定相的化學(xué)性質(zhì)外，HILIC中其他實驗參數(shù)（如有機溶劑、流動相pH、鹽濃度及柱溫）對極性化合物的保留及選擇性有很大影響［5，20，55］。由于 HILIC 分離中極性化合物在一些流動相pH下帶電荷，所以靜電作用在HILIC中對保留起著重要作用，靜電作用可以通過流動相pH及鹽濃度調(diào)節(jié)。最近，有作者通過測定不同性質(zhì)化合物（包括酸性、堿性及中性）在不同HILIC柱上的保留數(shù)據(jù)，以確定哪個實驗參數(shù)是影響HILIC分離中選擇性的最重要因素［55］。本文重點總結(jié)以硅膠為色譜柱的HILIC中影響溶質(zhì)保留及分離選擇性的主要因素，包括硅膠柱、有機溶劑、緩沖溶液及柱溫。

2.1 硅膠柱

未鍵合硅膠仍然是HILIC中廣泛使用的固定相，尤其是在生物分析領(lǐng)域［2－4，19，30］。由于 HILIC流動相中水相含量較高［36］，在NPLC中硅膠色譜柱所引起的溶質(zhì)不可逆吸附及保留重現(xiàn)性差等問題在HILIC中并不是難題［61］。許多色譜柱生產(chǎn)廠家研發(fā)制備出專門用于HILIC的硅膠柱，如Atlantis HILIC，Zorbax HILIC plus及YMC pack silica色譜柱等。用于HILIC的硅膠柱使用水／有機溶劑（如水及乙腈）填充及儲存，而不是正相溶劑。研究發(fā)現(xiàn)，不同的A型硅膠柱性能存在較大差異，這可能是因為A型硅膠純度低，金屬雜質(zhì)的含量不同且含量較高［62］；而B型硅膠柱的色譜性能相似，如McCalley比較了幾種不同酸性、堿性及中性化合物在3種不同B型硅膠柱上的分離情況，發(fā)現(xiàn)所考察化合物在3種色譜柱上的保留時間及分離選擇性均相似［59］。此外，Heaton及其合作者還發(fā)現(xiàn)B型硅膠與C型硅膠也具有非常相似的保留選擇性［40］。

亞乙基橋雜化（BEH）硅膠中約三分之一的表面Si－OH被除去，因此減弱了與Si－OH作用的化合物的保留，由于乙基橋鏈的嵌入使得BEH顆粒表面p Ka及殘留表面Si－OH的帶電狀態(tài)與經(jīng)典的硅膠表面不同，影響了其保留性能［48－50］。Grumbach等［48］比較了1.7μm的BEH顆粒與3μm未衍生硅膠填料的保留特性，發(fā)現(xiàn)在pH5時，未衍生的BEH顆粒具有更好的耐化學(xué)腐蝕性，其ESI－MS靈敏度比3μm硅膠高2.2～4.7倍。BEH顆粒優(yōu)越的化學(xué)及機械穩(wěn)定性在HPLC及UPLC中非常有用，可以允許HILIC方法開發(fā)中使用極限pH［48］。此外，根據(jù)核－殼技術(shù)制備的薄殼型多孔硅膠柱已用于HILIC分離，由于使用低黏度溶劑，故柱反壓低而柱效高，采用長柱（如45 cm）分離酸性及堿性溶質(zhì)的柱效率超過105塔板數(shù)，短柱的柱效比亞－2μm反相色譜填料的更高，并且已被證實在硅膠基質(zhì)反相色譜柱上超載的離子型堿性化合物在該色譜柱上不易超載［63］。

2.2 有機溶劑

2.2.1 有機溶劑類型

在大多數(shù)HILIC應(yīng)用中，乙腈是優(yōu)先使用的有機溶劑，其他溶劑如甲醇等常使樣品不能足夠保留及產(chǎn)生寬峰或不對稱峰［18，57，58，64］，因而 在 HILIC 中很少使用。甲醇在HILIC中的性能差可能因為其與水相似，都是質(zhì)子溶劑，與水競爭使硅膠表面溶劑化，彼此發(fā)生強的氫鍵作用，其他醇如乙醇及異丙醇等在較小程度上也可發(fā)生氫鍵作用。乙腈沒有質(zhì)子給予作用，因此采用乙腈時在極性固定相表面形成的水層與甲醇等有很大不同。有報道嘗試［18，57］采用低毒性的溶劑如乙醇或異丙醇代替乙腈，但至今為止仍不成功。

丙酮與乙腈極性相似，在HILIC條件下對溶質(zhì)顯示較弱保留及不同的選擇性［65］，然而丙酮在UV區(qū)有吸收，使得MS信號強度低，因此并不推薦采用丙酮代替乙腈［64］。在乙腈－水及乙醇－水流動相中加入二氧化碳會影響核酸堿基、皮質(zhì)醇、氟聯(lián)苯丙酸、茶堿及咖啡因在硅膠柱上的保留及分離選擇性，當乙醇－水流動相中含有高濃度的二氧化碳時，所考察溶質(zhì)的分離與在乙腈－水流動相中相似［66］。乙醇具有與乙腈相同的洗脫強度，但價格低很多，其產(chǎn)量巨大，并能被生物降解，所以是一個很有前途的取代溶劑［67，68］。

隨著HILIC技術(shù)的發(fā)展，也有將三元溶劑用于硅膠色譜柱的HILIC分離的報道。在三元流動相的HILIC系統(tǒng)中，可以通過改變兩種有機溶劑的濃度來調(diào)整溶質(zhì)的保留，但這種三元溶劑在HILIC中使用較少［2，65］。HILIC模式中有機溶劑的選擇性強烈地影響保留，有機溶劑的洗脫強度一般隨著溶劑極性及給予質(zhì)子／接受質(zhì)子能力的增大而增強，但溶劑的選擇性有很大差異。這主要是因為溶劑的選擇性受溶劑強度、溶劑－溶質(zhì)的定域化作用及溶劑－溶質(zhì)之間的氫鍵作用影響［57，58，64］。

2.2.2 有機溶劑濃度

與非水相的NPLC相似，HILIC模式中溶質(zhì)的保留隨其極性增大而增強。當固定相確定后，流動相中有機溶劑含量是控制分離的主要因素，隨著流動相中有機溶劑（如乙腈）含量的增大，極性化合物在固定相上的保留增強［20，64］。當流動相中有機溶劑含量改變時，可導(dǎo)致分離選擇性的改變甚至洗脫順序的改變，或分析物的 MS／MS檢測靈敏度變化［69］。

最近，Gritti等［70］以水－乙腈混合物為流動相，采用前沿分析法（FA）測定了吡啶在Halo柱上的等溫線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈含量低的富水液相色譜（per aqueous liquid chromatography，PALC）及乙腈含量高的HILIC中存在兩種不同的保留機理；在PALC模式中，吡啶在硅膠表面的吸附機理受非常少的極活潑吸附位點的疏水作用控制；而在HILIC模式中，吸附行為較均勻，吡啶保留受自由Si－OH的吸附作用控制。該課題組以咖啡因為模型化合物，在Halo柱上得到了相同的結(jié)論［71］。對于中間的流動相組成，Si－O－Si及Si－OH 分別被乙腈及水充分飽和，使得吡啶在Halo柱上的保留因子最?。闯蔝形）［70］。在此之前，也有作者發(fā)現(xiàn)隨著流動相中有機溶劑含量的改變一些溶質(zhì)在硅膠柱上的保留呈這種U 形模式，如氨基酸［68］、表阿霉素及其類似物［72］、苯及甲苯［54］等。

近來有研究報道，采用極性有機溶劑取代富乙腈流動相中的水，將該技術(shù)稱為“非水HILIC”（NA－HILIC）［73］。由于流動相中不含水，吸附在固定相上的液相擴散層為有機“質(zhì)子改性劑”，如乙烯二醇、甲醇或乙醇（洗脫強度依次降低），這些洗脫條件有時被稱為“有機極性模式”，對色譜選擇性有很大影響，彌補了“非水NPLC”及“水－有機HILIC”之間的缺口。NA－HILIC有助于分析低聚物或弱極性化合物，這些物質(zhì)可能在含水的HILIC流動相中沉淀。

2.3 緩沖溶液

在HILIC分離過程中，弱酸或弱堿可以以離子或非離子型體存在，溶質(zhì)以混合型體存在導(dǎo)致峰展寬、不規(guī)則峰，甚至分裂峰。在RPLC中，由于離子型體保留弱，離解通常被抑制。HILIC流動相常含有緩沖液，通過控制緩沖液的pH值及離子強度來調(diào)節(jié)離子型樣品的保留及分離選擇性［74］。與RPLC相反，通過選擇緩沖液pH值增大溶質(zhì)的電離度（對于酸，pH＞7；對于堿，pH＜7），從而達到調(diào)整其保留時間的目的。

拖尾峰在HILIC中比在RPLC操作中更常見，因為HILIC柱更易超載，峰形有時可通過增大流動相離子強度得以改善［40］。在流動相中加入三氟乙酸（TFA）通過形成離子締合體可以改善堿性化合物在硅膠柱上的峰形。無論是高緩沖液濃度還是TFA，在HILIC／MS應(yīng)用中均不推薦使用，因為它們抑制電噴霧離子化［75］，在實際操作中優(yōu)先使用甲酸。

2.3.1 緩沖液pH

流動相pH是非常重要的色譜參數(shù)，其影響固定相及極性溶質(zhì)的電荷狀態(tài)。帶電荷溶質(zhì)比其中性型體親水性更強，因此在HILIC中保留更強。對于硅膠柱，由于Si－OH的離子化，其電荷狀態(tài)也取決于流動相pH。當pH較高時（pH＞4～5），表面Si－OH去質(zhì)子化，硅膠帶負電［55］。硅膠柱表面電荷的這種變化對帶電溶質(zhì)的保留產(chǎn)生很大影響，如我們發(fā)現(xiàn)當緩沖液pH從2.4增大到6.5時，蒽環(huán)類堿性藥物在硅膠柱上的保留出現(xiàn)先增強后減弱的現(xiàn)象［57］。Liu等［76］發(fā)現(xiàn)隨著緩沖液pH （2.5～5.0）的增大，氨甲基吡啶異構(gòu)體在硅膠柱上的保留增強，而其降解產(chǎn)物的保留減弱，是因為多種作用（氫鍵及離子交換等）控制保留所致。此外有報道稱，隨著緩沖液pH值的增大，堿性化合物的保留時間縮短，分離變差［58］；中性化合物（如尿苷酸及脫氧尿苷酸）的保留略增強［55］，可能因為隨著pH 的升高，Si－OH 的離子化程度增大，使得硅膠表面的水層增厚，導(dǎo)致這些中性化合物的保留增強。

2.3.2 緩沖液類型

HILIC中帶電荷的極性固定相可以與帶電荷的溶質(zhì)發(fā)生顯著的靜電作用，反過來對其保留及選擇性有很大影響，流動相中不加緩沖液會導(dǎo)致拖尾峰或?qū)挿澹?6，40，77］。由于流動相中 有機溶 劑含量 高，需要采用能在高含量有機溶劑（如乙腈）中有足夠溶解度的鹽（如甲酸鹽及乙酸鹽等），這些鹽的另外一個優(yōu)點是它們可揮發(fā)，與ESI－MS檢測器兼容［40］。

不同的緩沖鹽對相同溶質(zhì)的保留有很大不同，如土霉素在以甲酸鹽、磷酸鹽及草酸鹽為緩沖液時在硅膠柱上的保留［77］，以及芳香胺類化合物在草酸鹽及磷酸鹽為緩沖液時的保留等［58］，但使用乙酸鹽及甲酸鹽時乙酰水楊酸及胞嘧啶在硅膠柱上的保留沒有差異，而使用碳酸氫銨時乙酰水楊酸的保留顯著降低，但胞嘧啶的保留受影響較?。?8］。一些溶質(zhì)當采用不同緩沖液時在硅膠柱上的保留沒差異，但在薄殼型多孔硅膠柱上有顯著差異［79］。緩沖液的類型對酸性及堿性溶質(zhì)的分離選擇性有很大影響，如酸性溶質(zhì)在甲酸銨緩沖液中保留弱，或呈現(xiàn)排斥；堿性溶質(zhì)在甲酸銨緩沖液中的峰形好［36］。緩沖液的pH及離子強度也會影響溶質(zhì)峰形，因為它們影響了親水作用及離子作用對保留的相對貢獻［40］。

2.3.3 緩沖液濃度

緩沖液濃度對選擇性的影響較小，但可有效地減小帶電荷溶質(zhì)與固定相之間的靜電作用（包括吸引及排斥），隨著鹽濃度的增大，對帶正電荷溶質(zhì)的保留減弱，而對帶負電荷溶質(zhì)的保留增大［36，55，80］。此外，緩沖液濃度影響離子型溶質(zhì)尤其是堿性化合物在硅膠柱上的峰形［40］。

鹽濃度除了調(diào)節(jié)帶電溶質(zhì)與固定相之間的靜電作用外，還發(fā)現(xiàn)對不存在靜電作用的溶質(zhì)保留也產(chǎn)生影響，如Guo等［78］研究發(fā)現(xiàn)，當乙酸銨的濃度增大時，胞嘧啶在硅膠固定相上的保留略增強，而胞嘧啶在實驗條件下不帶電荷，硅膠固定相帶負電荷。有人提出更高的鹽濃度可能增大了固定相表面富水層體積，進而使保留增強［55，81］。盡管該假設(shè)與親水分配模型相符，但沒有直接的實驗證據(jù)證明鹽濃度增大對富水層產(chǎn)生影響。

Guo等［81］采用一種實驗設(shè)計（DOE）方法研究了多種色譜條件（如乙腈含量、柱溫及鹽濃度）對極性化合物在不同固定相上保留的影響。響應(yīng)面分析證實在所考察的乙腈濃度及柱溫范圍內(nèi)，鹽濃度對保留的影響并不恒定。鹽濃度在較高乙腈濃度及較低柱溫時對保留的影響更大，而且DOE研究結(jié)果也證明了色譜條件（如乙腈含量、柱溫及鹽濃度）的相對重要性。最近Kumar等［55］通過實驗也得出了類似結(jié)論。

鹽濃度的影響考察大多在固定柱溫及流動相中有機溶劑含量的情況下進行，使得鹽濃度為唯一變量，這些研究并未提供鹽濃度與其他色譜條件如有機溶劑含量及柱溫之間的關(guān)系［64］。

2.4 溫度

在HILIC中，溫度不僅影響流動相黏度及溶質(zhì)的擴散系數(shù)，而且影響溶質(zhì)在流動相與固定相之間的焓變（ΔH），因此柱溫對溶質(zhì)保留有很大影響。溶質(zhì)保留與柱溫之間的關(guān)系可以用van’t Hoff曲線描述，從van’t Hoff曲線的線性或非線性可知保留機理在所考察溫度范圍內(nèi)是否發(fā)生改變或是否有多種作用控制保留［82］。

Hao等［74］報道了6種氨基酸類化合物在Atlantis硅膠柱上的van’t Hoff曲線圖，其中3種化合物（甘氨酸及其二、三肽）的van’t Hoff曲線圖呈現(xiàn)很好的線性，而它們的3種葡萄糖衍生物的van’t Hoff曲線圖則呈彎曲狀。所有化合物在實驗條件下均帶正電荷，van’t Hoff曲線出現(xiàn)彎曲不能簡單地解釋為與去質(zhì)子化表面Si－OH的靜電作用，因為甘氨酸及其二、三肽與它們的葡萄糖衍生物的靜電作用相似，但前者沒有出現(xiàn)彎曲。后者的van’t Hoff曲線出現(xiàn)彎曲是由于存在的葡萄糖部分產(chǎn)生氫鍵作用所致。Dong及Huang［72］研究了溫度對極性藥物分子在高純硅膠柱中保留行為的影響，發(fā)現(xiàn)在HILIC模式下，溫度對溶質(zhì)保留的影響與流動相中有機溶劑的類型、離子強度及pH值密切相關(guān)，通過對色譜保留機理的探討，證明保留機理的多重性導(dǎo)致了不同流動相中溶質(zhì)保留對溫度出現(xiàn)不同的響應(yīng)結(jié)果。

大多數(shù)HILIC系統(tǒng)中溫度的影響用van’t Hoff曲線描述是合適的，然而也有一些HILIC系統(tǒng)，當溫度升高時保留值增大，或更多的是保留與溫度無關(guān)［78］；更重要的是，峰寬隨著溫度的升高變得更窄，柱效提高［72，74］。溫度對相同溶質(zhì)在A型及B型硅膠柱上保留行為的影響相反，如6種氨基酸類化合物在A型硅膠柱上的van’t Hoff曲線斜率均為負值，但在B型硅膠上的van’t Hoff曲線斜率均為正值［74］。HILIC中溶質(zhì)保留通常隨溫度升高而降低，是因為減小了結(jié)合能、流動相及固定相之間的氫鍵作用及其他極性作用［81］，但是溫度改變對保留的影響比流動相組成的影響小［55，81］。對于分子大小或形狀及氫鍵堿性不同的化合物，尤其是部分可離解的溶質(zhì)，溫度對其分離選擇性影響較大［5，83］。在經(jīng)典HPLC中采用高溫色譜，可以獲得高柱效及快速分析，避免了采用長柱時高反壓的產(chǎn)生［84］。

3 結(jié)論與展望

硅膠是HILIC分離中使用最多的固定相，尤其是近幾年來，由于亞－2μm小粒徑硅膠、核－殼型硅膠、有機雜化硅膠等新型硅膠的出現(xiàn)，使得以硅膠為色譜柱的HILIC分離技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，進一步擴大這些新型固定相在HILIC分離中的實際應(yīng)用將是一個重要的研究熱點。

目前基于硅膠色譜柱的HILIC分離機理仍存有爭議，但其混合保留機理已得到認可。HILIC體系的機理比RPLC或非水的NPLC體系更復(fù)雜，一些特殊結(jié)構(gòu)樣品的分離與流動相有很大關(guān)系。離子型樣品的分離可通過添加鹽、弱酸或堿等改善分離。不同的樣品分子在亞－2μm小粒徑硅膠、核－殼型硅膠、有機雜化硅膠等新型硅膠中的保留機理研究將是一個重要的研究方向。

影響HILIC分離的因素較多，通過優(yōu)化多個色譜參數(shù)，可以實現(xiàn)目標組分和基體干擾物質(zhì)的分離。乙腈是HILIC中常用的流動相有機組分，采用其他的極性有機溶劑取代乙腈的嘗試至今不成功，HILIC通往“綠色”流動相還需要很長一段歷程。采用非水流動相的“有機極性模式”分離系統(tǒng)（即非水HILIC）由乙腈及作為極性溶劑的醇組成，使得HILIC應(yīng)用擴大到極性較弱的樣品。

總的來說，HILIC已經(jīng)是HPLC技術(shù)中不可缺少的分離技術(shù)之一。我們期望新的HILIC填料不斷出現(xiàn)，用于各種各樣的極性樣品分離，而且能在一次運行中同時分離強極性和弱極性組分。此外，盡管美國EPA1694方法將HILIC作為標準分析方法用于測定環(huán)境樣品中的PPCPs，但要成為實驗室的常規(guī)方法還需要做大量工作。

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