張 鵬 周駿輝 荊艷萍

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

楊樹授粉親和性與雌蕊生理生化變化的關(guān)系1)

張 鵬 周駿輝 荊艷萍

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

對楊樹不同親和性授粉過程中(加楊×加楊,加楊×銀腺楊)花粉的萌發(fā)及花粉管的伸長進行了熒光染色觀察，并對雌蕊的內(nèi)源性激素及保護性酶的含量進行分析。結(jié)果表明，加楊×銀腺楊授粉后花粉管伸長明顯慢于加楊×加楊，同時，授粉均引發(fā)了柱頭保護性酶SOD和POD的波動，但兩種授粉所引發(fā)的酶活性變化不同，加楊×加楊授粉后SOD活性升高要早于加楊×銀腺楊，而加楊×銀腺楊授粉后POD活性在增加過程中有下降的變化。加楊×加楊授粉后雌蕊內(nèi)源激素生長素(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米核苷素(ZR)等質(zhì)量分數(shù)要高于加楊×銀腺楊，而ABA質(zhì)量分數(shù)遠低于加楊×銀腺楊。結(jié)果表明，SOD活性的延遲升高,低水平的IAA、GA3、ZR以及高水平的ABA可能對授粉后花粉管的伸長起抑制作用，是引發(fā)楊樹雜交授粉不親和性的原因之一。

楊樹；雜交授粉；內(nèi)源激素；保護性酶

授粉是大部分植物進行繁衍的前提，花粉與柱頭接觸后，主要經(jīng)過花粉萌發(fā)和花粉管伸長這兩個階段，并最終到達胚珠和胚囊[1]，這一過程受到多種酶的調(diào)節(jié)[2]。在甘藍(Brassicaoleracea)[3]、百合(Lilium)[4]、蘋果(Malusdomestica)[5]、郁金香(Tulipa)[6]等植物中，均發(fā)現(xiàn)SOD、POD等保護性酶在授粉過程中含量發(fā)生明顯變化，并且授粉親和性品種與不親和性品種中，上述酶的變化趨勢也存在差異。此外，花粉管的生長與花柱中內(nèi)源激素的變化相關(guān)[7]。梨屬植物授粉后，雜交親和性授粉的花柱內(nèi)激素變化與自花不親和授粉的花柱不同[8]，親和性授粉花柱中促進生長的激素如IAA、GA3、ZR等含量均高于不親和授粉的花柱，而ABA含量顯著低于不親和授粉的花柱。楊曉苓等[4]也認為高水平的ABA與雜交不親和授粉機理相關(guān)。

楊樹派間雜交育種過程中存在嚴重的雜交不親和現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為授粉后花粉萌發(fā)率低或花粉管生長緩慢、花粉管在柱頭上表現(xiàn)異常，扭曲、盤繞、爬行等現(xiàn)象[9]，而有關(guān)楊樹雜交授粉不親和性機制的研究尚不多見。本研究主要探究不同親和性楊樹授粉后花柱內(nèi)的保護性酶及激素含量的變化，以期闡明保護性酶及內(nèi)源激素與楊樹雜交授粉不親和性的關(guān)系，進而為楊樹雜交育種工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

以雌性加楊(北京林業(yè)大學(xué)校區(qū))為母本，雄性加楊(北京林業(yè)大學(xué)校區(qū))和銀腺楊(山東冠縣苗圃)為父本。在2012年2月上旬采集發(fā)育良好帶有花芽的枝條，于溫室水培。雄蕊成熟前1周套袋收集花粉，花粉儲藏在冰箱中-20 ℃保存。雌蕊柱頭長出后觀察可授性。對處于可授期的雌蕊進行人工授粉，分2種組合進行：加楊×加楊、加楊×銀腺楊。在授粉后1、2、5、10、24和48 h時間段分別取雌蕊，一部分放入FAA固定液用于觀察花粉管伸長情況，另一部分于冰箱-80 ℃保存。

1.1 授粉后不同時期花粉管行為的熒光觀察

分批水培雌性加楊枝條,當(dāng)雌蕊進入最佳可授期之后進行人工授粉。并于授粉后1、2、5、10、24和48 h分時間段收集樣品，每個時間段加楊和銀腺楊授粉的雌蕊各取若干，以FAA固定液固定2 h以上，轉(zhuǎn)移到70%酒精之中保存，用蒸餾水清洗3次，每次3 min，以洗去固定液。將花柱從雌蕊上剪下，然后用5mol/L氫氧化鈉解離40 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，再用0.1%水溶性苯胺藍避光染色20 min并壓片。在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā),觀察花粉萌發(fā)和花粉管伸長情況，并照相記錄。

1.2 雌蕊中保護性酶和激素含量的測定

分批水培雌性加楊枝條，當(dāng)雌蕊進入最佳可授期后進行人工授粉，并收集未授粉及授粉后1、2、5、10、24和48 h的雌蕊，每個時間段加楊和銀腺楊授粉的雌蕊各0.5 g，液氮冷凍后轉(zhuǎn)移到冰箱中-80 ℃保存，重復(fù)3次。超氧化物歧化酶(SOD)測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法，過氧化物酶(POD)測定采用愈創(chuàng)木酚法[10]。應(yīng)用酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測定雌蕊柱頭四種激素——生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米核苷素(ZR)和脫落酸(ABA)的含量[11]。激素試劑盒及酶標(biāo)板購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，各時期樣品激素測定重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 授粉后花粉在雌蕊上的生長動態(tài)

加楊×加楊和加楊×銀腺楊兩種組合授粉后不同時間段的花粉萌發(fā)和花粉管伸長情況如圖1所示。授粉后1和2 h兩種授粉組合均沒有大量花粉萌發(fā)。授粉后5 h，加楊授粉的花粉已經(jīng)萌發(fā)，花粉管伸長到一定長度；銀腺楊授粉的花粉也已經(jīng)萌發(fā)，但花粉管伸長長度較短。授粉后10 h，加楊授粉的花粉管繼續(xù)伸長，長度約到達整個花柱的1/2處；銀腺楊的花粉管伸長速度較慢，長度約到整個花柱的1/4處。授粉后24 h，加楊授粉的花粉管伸長到接近花柱的末端；銀腺楊的花粉管伸長到整個花柱的1/2處。授粉后48 h(此時兩組授粉的柱頭都已經(jīng)萎蔫)，加楊授粉的花粉管穿越花柱到達子房；銀腺楊的花粉管則停止伸長(或者伸長速度很慢)，仍然停留在整個花柱的1/2處。

2.2 授粉后雌蕊保護性酶的含量變化

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

人工授粉加楊和銀腺楊花粉后，加楊雌蕊中SOD活性變化如表1所示。雌蕊進入最佳可授期時，即未授粉時SOD活性最大，授粉后SOD活性開始下降。在加楊授粉后2 h SOD活性開始上升，到授粉后5 h達到一個峰值之后SOD活性緩慢下降。

表1 人工授粉后雌蕊中SOD活性變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

銀腺楊授粉后直到5 h SOD活性才停止下降，此時花粉管的長度較短。授粉后5～10 h，SOD活性開始上升并達到一個峰值，之后SOD活性急劇下降，至授粉后24 h后，SOD活性下降趨勢較平穩(wěn)，但SOD活性已處于較低水平。

除授粉后2 h和授粉后10 h的部分時間里加楊授粉的雌蕊柱頭SOD活性低于銀腺楊授粉組合外，其余時間均是加楊×加楊的SOD活性高于加楊×銀腺楊授粉組合。

2.2.2 過氧化物酶活性變化

人工授粉加楊和銀腺楊花粉后雌蕊中POD活性變化如表2所示。未授粉前雌蕊中POD活性很低，授粉后加楊和銀腺楊的POD活性均顯著上升。授粉后2～5 h，加楊的POD上升趨勢減緩，而此時花粉開始萌發(fā)，花粉管快速伸長。授粉后5～24 h，POD活性再次急劇上升。

表2 人工授粉后雌蕊中POD活性變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

銀腺楊授粉后雌蕊柱頭POD活性在授粉后5～10 h開始緩慢下降，此時為銀腺楊花粉管的快速生長期。授粉后10～24 h，POD活性也急劇上升。

加楊和銀腺楊授粉后雌蕊柱頭POD活性變化除授粉后2～10 h有顯著差異外，其余時間變化趨勢基本一致。

2.3 授粉后花柱內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)變化

2.3.1 IAA、GA3及ZR質(zhì)量分數(shù)變化

如表3—表5所示，加楊×加楊授粉組合雌蕊中IAA質(zhì)量分數(shù)在授粉2 h內(nèi)未發(fā)生明顯變化，2～10 h迅速升高，而后在10～48 h發(fā)生回落。加楊×銀腺楊組合在授粉后2 h內(nèi)IAA質(zhì)量分數(shù)有一定上升，2～10 h急劇下降并持續(xù)穩(wěn)定。

1～6為加楊授粉后1、2、5、10、24、48 h花粉在雌蕊上的發(fā)育過程，7～12為銀腺楊授粉后1、2、5、10、24、48 h花粉在雌蕊上的發(fā)育過程。

授粉后時間/hIAA質(zhì)量分數(shù)/ng·g-1加楊×加楊加楊×銀腺楊0143．87±2．05143．87±2．051154．74±2．84177．04±3．392159．10±3．52192．40±2．775213．48±3．41129．93±6．0610260．12±6．7273．50±1．8124240．19±3．5077．56±1．0248208．43±5．2077．53±2．03

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

加楊×加楊和加楊×銀腺楊雌蕊在授粉后GA3變化趨勢基本相同，均為24 h內(nèi)略有下降，而24～48 h迅速上升并高于初始未授粉柱頭GA3水平。但在整體變化過程中，加楊×銀腺楊GA3質(zhì)量分數(shù)一直低于加楊×加楊授粉組合。

加楊×加楊授粉組合ZR質(zhì)量分數(shù)在授粉后穩(wěn)定上升，但上升幅度不大，并于24～48 h內(nèi)出現(xiàn)一定程度的下滑。而加楊×銀腺楊ZR質(zhì)量分數(shù)在授粉后1 h之內(nèi)有一定上升，2～5 h迅速下降，并在之后的時間內(nèi)持續(xù)下降。

表4 楊樹雌蕊中GA3質(zhì)量分數(shù)變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

整體來看，不同授粉組合的上述3種激素在雌蕊中質(zhì)量分數(shù)的改變趨勢有所差別，但加楊×加楊授粉后3種激素質(zhì)量分數(shù)均整體高于加楊×銀腺楊。

2.3.2 脫落酸(ABA)質(zhì)量分數(shù)變化

如表6所示，兩種授粉組合柱頭內(nèi)ABA含量變化與IAA、GA3及ZR3種激素質(zhì)量分數(shù)變化完全相反。在授粉初始階段，加楊×銀腺楊雌蕊柱頭ABA質(zhì)量分數(shù)便迅速升高，直至5 h后達到頂點，之后持續(xù)下落。而加楊×加楊A(yù)BA質(zhì)量分數(shù)在2 h內(nèi)呈現(xiàn)小幅波動，2～48 h持續(xù)下落至最低點。總體上看，加楊×加楊A(yù)BA質(zhì)量分數(shù)始終遠低于加楊×銀腺楊授粉組合，且呈現(xiàn)整體下落趨勢。

表5 楊樹雌蕊中ZR質(zhì)量分數(shù)變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

表6 楊樹雌蕊中ABA質(zhì)量分數(shù)變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

2.3.3 授粉后雌蕊(IAA+GA3+ZR)/ABA變化

為了進一步對比不同授粉組合中柱頭內(nèi)源激素的變化關(guān)系，計算授粉后不同時間的雌蕊(IAA+GA3+ZR)/ABA比值如表7。在整個授粉過程中，加楊×加楊雌蕊(IAA+GA3+ZR)/ABA含量明顯高于加楊×銀腺楊，兩者之間的差異從2 h之后開始逐漸增大。

表7 楊樹雌蕊中(IAA+GA3+ZR)/ABA比值的變化

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準差”。

3 結(jié)論與討論

本研究中，加楊×加楊授粉后花粉管延伸順利，速度快，而加楊×銀腺楊授粉后花粉管延伸不暢，延伸速度慢且最終停滯于整個花柱的1/2附近。研究表明，授粉可以引發(fā)SOD和POD的活性變化，高水平的SOD和POD有利于親和花粉與柱頭的識別、黏附和萌發(fā)。百合授粉3 h內(nèi)，親和性授粉的酶活性高于不親和性授粉的酶活[4]。本研究中，授粉后SOD和POD活性呈現(xiàn)波動，并且加楊×加楊與加楊×銀腺楊授粉后兩種酶的變化趨勢不同。SOD活性在花粉識別階段下降，而在花粉管快速伸長時上升，但加楊×加楊授粉后SOD活性要先于加楊×銀腺楊上升。當(dāng)花粉管延伸減緩時，SOD活性下降，并且加楊×加楊SOD活性也先于加楊×銀腺楊下降。上述結(jié)果表明，較高活性的SOD利于花粉的生長?？赡芘c花粉快速生長需要消耗大量的氧[12]，而線粒體在有氧代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子自由基[13]，超氧陰離子自由基的清除需要SOD有關(guān)。

POD的活性在加楊和銀腺楊的授粉試驗中均呈現(xiàn)整體上升趨勢。但在加楊×銀腺楊授粉后POD有一個明顯的上升后下降的過程，由于POD也是一種細胞壁酶[2]，它參與細胞壁內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，果膠和半纖維素的交聯(lián)反應(yīng)，從而使細胞壁硬化，控制細胞的生長速度。加楊×銀腺楊授粉后期POD活性下降，可能與其花粉管生長受到抑制有關(guān)。

植物內(nèi)源激素和其他信號分子一起通過復(fù)雜的相互作用決定細胞的命運，與植物花粉的萌發(fā)、花粉管生長、授粉受精過程密切相關(guān)[14-15]。在實驗室條件下，一定質(zhì)量分數(shù)的IAA及GA3可以促進花粉萌發(fā)及花粉管的伸長[16]。齊國輝等[8]在對鴨梨花柱的研究中認為高水平的IAA、ZR和GA3均有利于花粉的萌發(fā)和正常的受精作用。煙草花柱中的IAA含量最高時，柱頭上花粉可以大量萌發(fā)[17]。許明等[18]在對紫菜薹的研究中認為低水平的IAA、GA3及ZR誘發(fā)了自交授粉不親和過程的不結(jié)實效應(yīng)。白楊雜交實驗中也發(fā)現(xiàn)低水平的IAA與花粉的變形扭曲有關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明，加楊×加楊雌蕊柱頭中的IAA，GA3及ZR等激素水平相比加楊×銀腺楊處于較高的水平，表明高質(zhì)量分數(shù)的IAA、GA3及ZR等參與了花粉與柱頭的應(yīng)答，誘導(dǎo)并促進了花粉的萌發(fā)。而加楊×銀腺楊中由于IAA、GA3及ZR等激素水平較低，一定程度上抑制了花粉管的伸長，低水平的IAA、GA3及ZR誘發(fā)了楊樹雜交授粉的不親和現(xiàn)象。這與前人關(guān)于自交授粉不親和機制研究中的相關(guān)結(jié)果一致[8]。Lewis和Crowe等人曾提出：種間雜交不親和與自交不親和具有很多相似性[19]，我們的結(jié)果也印證了這一點。

高水平的ABA是花粉萌發(fā)及伸長過程中的不利因素，能夠引起種間不親合授粉后楊樹花的脫落[20]，也是矮牽牛授粉不親和的原因[21]。ABA也被發(fā)現(xiàn)能夠抑制花粉的體外萌發(fā)[16]。本實驗中測得授粉不親和樣本雌蕊柱頭ABA質(zhì)量分數(shù)遠高于親和樣本，也說明高濃度的ABA可能是抑制雜交不親和授粉雌蕊柱頭花粉伸長的原因之一。

(IAA+GA3+ZR)/ABA的比值較低是一些物種自交不親和授粉后的特點[8]，我們對實驗中兩種授粉組合雌蕊柱頭的(IAA+GA3+ZR)/ABA進行計算，發(fā)現(xiàn)雜交不親和樣品的(IAA+GA3+ZR)/ABA遠低于親和授粉樣品，說明4種內(nèi)源激素之間量的變化關(guān)系與雜交不親和授粉后花粉的萌發(fā)與伸長具有一致性，較低的(IAA+GA3+ZR)/ABA是楊樹雜交不親和性產(chǎn)生的原因之一。

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Relationship Between Physiological and Biochemical Changes in Pistil and Pollination Compatibility of Poplar/Zhang Peng, Zhou Junhui, Jing Yanping

(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(6).-11～14，33

We obsevered pollen germination and pollen tube growth after pollinations (PopulusCanadensisMoench×P.CanadensisMoench andP.canadensisMoench×P.alba×P.glandulosa) with a fluorescence microscope, and analyzed the content of endogenous hormones and protective enzymes of pistils. The pollen tubes ofP.canadensisMoench×P.alba×P.glandulosasamples grow significantly slower than that of theP.canadensisMoench×P.canadensisMoench, and different pollination combination initiated the coordinated variation of content of protective enzymes and endogenous hormones in pistil. The SOD activity inP.canadensisMoench×P.canadensisMoench increases earlier than that ofP.canadensisMoench×P.alba×P.glandulosa, whereas, the POD activity of the latter shows a downward change during the process of ascent. Hormones including IAA, GA3 and ZR are higher inP.canadensisMoench×P.canadensis, while the ABA content is much lower than that inP.canadensisMoench×P.alba×P.glandulosa. The delay of SOD activity increase, the low contents of IAA, GA3, ZR and high concent of ABA are possible reasons on leading to cross-pollination incompatibility of poplar.

Poplar; Cross-pollination; Endogenous hormones; Protective enzymes

1) 國家自然科學(xué)基金(30700636)資助。

張鵬，男，1986年12月生，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，碩士研究生。

荊艷萍，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，副教授。E-mail:ypjing@bjfu.edu.cn。

2013年8月14日。

S718.43

責(zé)任編輯：潘 華。