許月明，張 爽，湯 強(qiáng)，童傳旺

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241003)

DPPH法測(cè)定蒲公英不同部位抗氧化成分含量及其規(guī)律研究

許月明，張 爽，湯 強(qiáng)，童傳旺

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241003)

蒲公英的抗氧化成分是目前研究的熱點(diǎn)，文章采用DPPH法對(duì)蒲公英不同生長(zhǎng)期、不同部位的水分和抗氧化成分高低進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明：蒲公英水分含量和抗氧化成分之間的關(guān)聯(lián)性不是很明顯；同一生長(zhǎng)期不同部位的蒲公英植株抗氧化成分含量有明顯的不同；DPPH薄層的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分光光度法的結(jié)果基本一致。

蒲公英；DPPH；CH3OH提取物；自由基清除活性

0 引言

蒲公英在我國(guó)廣大地區(qū)隨處可見，生于田間、道旁、荒地、草地、河岸、庭園等處，來(lái)源廣泛，屬于典型的藥食兼用植物。幾千年來(lái)，我國(guó)人民經(jīng)常采集蒲公英植株作為野菜食用，蒲公英富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等，具備非常豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值；同時(shí)蒲公英植物體中含有蒲公英醇、蒲公英素、膽堿、有機(jī)酸、菊糖等成分，具有抗病原微生物、提高免疫功能、利膽保肝等功效，因而蒲公英亦是一味很好的中草藥，其藥用價(jià)值極高，成為研究的熱點(diǎn)，其中抗氧化活性是重要的研究?jī)?nèi)容之一[1]。

蒲公英中的抗氧化成分屬于天然自由基清除劑，它能與自由基發(fā)生反應(yīng)，因而可通過與自由基反應(yīng)測(cè)定其總抗氧化成分[2]。目前有多種測(cè)定抗氧化成分的方法，如：FRAP法、T-AOC法、TEAC法等[3]，大都通過測(cè)定蒲公英中的某幾種抗氧化物質(zhì)的活性來(lái)研究其總抗氧化成分[4]，這些方法容易遺漏其它的抗氧化物質(zhì)，不夠全面。故本文采用DPPH法對(duì)蒲公英中抗氧化成分活性進(jìn)行研究，DPPH(C18H12N5O6)是一種以氮為中心的有機(jī)自由基，性質(zhì)穩(wěn)定，其CH3OH溶液呈現(xiàn)紫色，且在517 nm處有強(qiáng)烈吸收，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，會(huì)提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子進(jìn)行配對(duì)，而使其褪色，褪色的程度與其接受的電子呈定量關(guān)系[5]。

1 研究方法

1.1 新鮮蒲公英樣品水分測(cè)定

采集新鮮蒲公英植株，流動(dòng)水沖洗表面灰塵、雜質(zhì)等，瀝干水分。分別取蒲公英幼苗植株中的葉、葉梗和根、蒲公英開花植株中的葉、葉梗、根、花、花梗和花托以及蒲公英結(jié)籽植株的葉、葉梗、根和籽備用。利用電子天平分別稱取120～130 mg(精確至0.000 1 g)樣品1份，置于5 mL的Eppendoff管(已干燥恒重)中，放入烘箱，在溫度101 ℃時(shí)烘到恒重，測(cè)定水分含量。

1.2 自由基清除劑的測(cè)定

測(cè)定自由基清除率的公式為[1-(Ap-Ac)/Amax]×100%[6]。再利用濃度和自由基清除率間對(duì)應(yīng)關(guān)系，求出自由基清除率為50%時(shí)樣品溶液的濃度( IC50)。一般IC50值越小，則表示該樣品的自由基清除活性越高。

1.2.1 Ap的測(cè)定

移液器分別吸取1 000 μL的待檢測(cè)樣品溶液和1 000 μL的DPPH試液，置于5 mL的Eppendoff管中，搖勻。轉(zhuǎn)移于光程0.5 cm的比色皿中，平行測(cè)定2次。

1.2.2 Ac的測(cè)定

移液器分別吸取1 000 μL的待檢測(cè)樣品溶液和1 000 μL的CH3OH，置于5 mL的Eppendoff管中，搖勻。轉(zhuǎn)移于光程0.5 cm的比色皿中，平行測(cè)定2次。

1.2.3 Amax的測(cè)定

移液器分別吸取1 000 μL的CH3OH和1 000 μL的DPPH試液，置于5 mL的Eppendoff管中，搖勻。轉(zhuǎn)移于光程0.5 cm的比色皿中，平行測(cè)定2次。

1.3 自由基清除劑薄層檢識(shí)分析

用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取各個(gè)40 mg/mL的樣品，在薄層板上點(diǎn)樣，然后在以CHCl3∶CH3OH∶H2O=50∶50∶5的混合溶液和2 d CH3COOH的展開劑中展開。展開后，在波長(zhǎng)254 nm的紫外光下，用數(shù)碼相機(jī)記錄圖譜。然后，噴灑1 mg/mL的DPPH試劑，等薄層板上的DPPH試劑干燥后，用數(shù)碼相機(jī)再次記錄圖譜。顯黃色處為清除自由基成分，因?yàn)镈PPH為一種穩(wěn)定的自由基，能強(qiáng)烈吸收517 nm的長(zhǎng)波(呈紫色)，當(dāng)自由基清除劑反應(yīng)后，其吸收波長(zhǎng)藍(lán)移(變黃色)，因此通過觀察薄層板上的顏色變化可判定出提取物中自由基清除劑在薄板上的位置[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英植株同一時(shí)期不同部位含水率的比較

2.1.1 蒲公英幼苗期不同部位含水率的比較

按樣品水分測(cè)定方法，測(cè)定蒲公英幼苗期的不同部位(葉、葉梗、根)的含水率，結(jié)果見表1。

表1 蒲公英幼苗期不同部位含水率

由表1中的數(shù)據(jù)可見，蒲公英幼苗期的3個(gè)部位的含水率都很高，其中以葉梗部位的含水率為最高，葉次之，而根部的含水率相比較最少。

2.1.2 蒲公英開花期不同部位含水率的比較

按樣品水分測(cè)定方法，測(cè)定蒲公英開花期的不同部位(葉、葉梗、根、花、花梗、花托)的含水率，結(jié)果見表2。

表2 蒲公英開花期不同部位含水率

由表2可知，葉梗的含水率最高；其次是花梗；再次之為葉與花的含水率，它們均為85.9%；緊接著為花托，其含水率是85.6%，與葉和花很接近，這表明在蒲公英開花期，在誤差允許的范圍內(nèi)，葉、花和花托部位的水分十分接近；含水率最少的還是根部位，為83.1%。

2.1.3 蒲公英結(jié)籽期不同部位含水率的比較

按樣品水分測(cè)定方法，測(cè)定蒲公英結(jié)籽期的不同部位(葉、葉梗、根、籽)的含水率，結(jié)果見表3。

表3 蒲公英結(jié)籽期不同部位含水率

由表3可知，蒲公英結(jié)籽期的不同部位(葉、葉梗、根)的含水率與幼苗期、開花期近似，但籽的含水率明顯偏少。按含水率由大到小排列，發(fā)現(xiàn)結(jié)籽期的葉梗依然位居首位，葉次之，而根部在之后，含水率最低的是籽部位。不僅如此，籽部位的含水率與其它3個(gè)部位的含水率相比較而言，其表現(xiàn)的很低，僅為30.6%。

2.2 蒲公英植株幼苗期、開花期、結(jié)籽期不同部位自由基清除率的比較

2.2.1 蒲公英幼苗期不同部位自由基清除率的比較

按樣品自由基清除率檢測(cè)方法，測(cè)定蒲公英幼苗期的不同部位(葉、葉梗、根)的自由基清除率，結(jié)果見圖1。

圖1 蒲公英幼苗期不同部位自由基清除率的比較

由圖1可見，蒲公英幼苗期的3個(gè)部位的IC50的大小順序：葉<葉梗<根。根據(jù)排序可以得出蒲公英幼苗不同部位的抗氧化成分含量的高低：葉>葉梗>根。

2.2.2 蒲公英開花期不同部位自由基清除率的比較

按樣品自由基清除率檢測(cè)方法，測(cè)定蒲公英開花期的不同部位(葉、葉梗、根、花、花梗、花托)的自由基清除率，結(jié)果見圖2。

圖2 蒲公英開花期不同部位自由基清除率的比較

由圖2可見，蒲公英開花期不同部位的IC50的大小順序：花托<葉<花<葉梗<根<花梗。根據(jù)排序可以得出蒲公英開花期不同部位的抗氧化成分含量的高低：花托>葉>花>葉梗>根>花梗。

2.2.3 蒲公英結(jié)籽期不同部位自由基清除率的比較

按樣品自由基清除率檢測(cè)方法，測(cè)定蒲公英結(jié)籽期的不同部位(葉、葉梗、根、籽)的自由基清除率，結(jié)果見圖3。

圖3 蒲公英結(jié)籽期不同部位自由基清除率的比較

由圖3可見，蒲公英結(jié)籽期不同部位的IC50的大小順序：籽<葉<根<梗。根據(jù)排序可以得出蒲公英結(jié)籽期不同部位的抗氧化成分含量的高低：籽>葉>根>葉梗。

2.3 蒲公英植株不同生長(zhǎng)期、不同部位提取物的薄層檢識(shí)

按自由基清除劑薄層檢識(shí)分析法，對(duì)蒲公英甲醇提取物中的清除自由基活性物質(zhì)即抗氧化成分進(jìn)行檢驗(yàn)[8]。分別對(duì)不同時(shí)期不同部位的新鮮蒲公英CH3OH提取液(40 mg/mL)進(jìn)行DPPH薄層試驗(yàn)，用點(diǎn)樣毛細(xì)管對(duì)同一樣品各點(diǎn)樣2次，展開劑為CHCl3∶CH3OH∶H2O=50∶50∶5和2 d CH3COOH的混合溶液。未噴DPPH試劑時(shí)，在254 nm的紫外光下，用數(shù)碼相機(jī)記錄圖譜(區(qū)域A)；噴DPPH試劑后，等其干燥，用數(shù)碼相機(jī)再次記錄圖譜(區(qū)域B)，如圖4所示。

圖4 不同生長(zhǎng)期、不同部位的蒲公英甲醇提取物的薄層圖譜

如圖4所示，圖中的編號(hào)對(duì)應(yīng)部位如下：蒲公英幼苗植株中的葉、葉梗、根依次是10～11、12、13～14；蒲公英開花植株中的葉、葉梗、根、花、花梗、花托依次是15～16、17～18、19和21、22～23、24～25、26～27；蒲公英結(jié)籽植株中的葉、葉梗、根、籽依次是2～3、4～5、6～7、8～9。

從圖4中可以明顯看出：蒲公英不同部位的清除自由基活性成分含量不相同。其中，在蒲公英幼苗株期，葉部位的黃色斑點(diǎn)最深，說明葉部位的清除自由基活性強(qiáng)；在蒲公英開花株期，依據(jù)圖譜中的黃色斑點(diǎn)的深淺，可以看出清除自由基活性順序：花托>葉>花，但花托和葉的顏色深淺相近，差別不大；在蒲公英的結(jié)籽株期，可以看到葉和籽的黃色斑點(diǎn)都很深，但是籽中的黃色斑點(diǎn)的比移值明顯低于葉部位，它可能是其它物質(zhì)。從總體上觀察圖譜，可以看出蒲公英的根部位和梗部位的黃色斑點(diǎn)都很淺，說明了蒲公英的根部位和梗部位的清除自由基活性成分含量都很低。這些從圖譜和上述分析比較得出的結(jié)論與通過對(duì)實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出的結(jié)論是一致的。

2.4 討論

1)實(shí)驗(yàn)中主要采用分光光度法測(cè)定吸光度，從實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)和圖表可以看出，數(shù)據(jù)的線性相關(guān)性很好。但需注意以下內(nèi)容：測(cè)定溶液時(shí)，要求空白溶液與供試品溶液必須澄清，不能有渾濁；暫停檢測(cè)時(shí)，需打開試樣箱蓋，防止光電管受長(zhǎng)時(shí)間的照射而疲勞，影響檢測(cè)結(jié)果；一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.2～0.8之間的誤差較??；用擦鏡紙擦凈比色皿的透光面至不留斑痕。

2)實(shí)驗(yàn)中所獲得的自由基清除率數(shù)據(jù)是平行3次的平均值，可以看出蒲公英某些部位的清除自由基活性物質(zhì)很相近。

3)實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果，可以作為參考，若需準(zhǔn)確分析抗氧化成分變化的順序，還需開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槠压⒅仓曛械目寡趸煞趾颗c所處的環(huán)境如土壤、天氣等有關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

本文主要針對(duì)蒲公英不同生長(zhǎng)期、不同部位的水分和抗氧化成分進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)水分和抗氧化成分之間有一定的關(guān)聯(lián)，但作用不是很明顯。不同生長(zhǎng)期、不同部位蒲公英提取物的自由基清除能力與樣品濃度呈正相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)蒲公英的生長(zhǎng)期對(duì)同一部位的抗氧化成分變化影響不是很大，而同一生長(zhǎng)期不同部位的抗氧化成分變化則較為明顯，尤其是葉、花、花托、籽在每個(gè)生長(zhǎng)期中抗氧化成分都很高，與其它部位的區(qū)別十分明顯。DPPH薄層的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分光光度法的結(jié)果基本一致，在薄層板上可以明顯看到葉、籽、花、花托的黃色斑點(diǎn)較明顯，說明其抗氧化成分含量較高。

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[責(zé)任編輯：寸曉非]

2014-10-03

安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SQRL149ZD)；安徽省高等教育振興計(jì)劃重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2014zdjy154)；安徽省高等教育振興計(jì)劃重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2014zdjy155)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A284)；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目：食品技術(shù)人才實(shí)訓(xùn)中心校企合作實(shí)踐教育基地(2013sjjd036)

許月明(1980-)，女，安徽廬江人，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院副教授，碩士。

Q946

A

1008-4657(2014)06-0048-05