毛立梅+戴建華+張晏苗+包蔚雷+高園園+朱春富+張京平

[摘要] 目的 建立簡單、可靠、高效的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型，為研究膽石成因及防治提供重要手段。 方法 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，模型組喂飼致石飼料（基礎(chǔ)飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸）。兩組小鼠分別于喂養(yǎng)4周和8周后，計(jì)算小鼠存活率，同時(shí)各取一半數(shù)量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術(shù)取膽囊及血液標(biāo)本，分別檢測成石率、血脂濃度及膽汁膽固醇飽和度。 結(jié)果 對照組小鼠8周存活率100%，模型組小鼠死亡1只，存活率95%。對照組8周成石率為零，模型組4周成石率80%，8周成石率100%。血脂分析表明，與對照組比較，模型組4周和8周總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高（P<0.01），甘油三酯濃度輕度升高（P<0.05），高密度脂蛋白顯著降低（P<0.01）。4周和8周時(shí)膽汁膽固醇飽和度測定，對照組分別為0.48±0.29和0.58±0.21，模型組分別為1.36±0.36和1.52±0.37，模型組膽固醇濃度處于過飽和狀態(tài)。 結(jié)論 本模型方法簡單、成石率高、動(dòng)物死亡率低，可作為研究膽石成因及防治的備選模型。

[關(guān)鍵詞] 膽固醇結(jié)石；膽囊；模型；小鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）06-30-04

膽囊結(jié)石（主要為膽固醇結(jié)石）是常見病，且其發(fā)病率有增高趨勢[1]。目前膽囊結(jié)石的形成機(jī)制尚不清楚[2-3]。建立方法簡單、效果確切的膽囊結(jié)石動(dòng)物模型可以為研究膽石成因及其防治提供極大便利。本文介紹一種簡單、高效的C57BL/6小鼠膽

囊膽固醇結(jié)石模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 飼料及處理

基礎(chǔ)飼料按照美國營養(yǎng)學(xué)會(huì)嚙齒類AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方制定[4]。致石飼料為基礎(chǔ)飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸。致石飼料在喂飼前放于蒸籠中蒸汽熏蒸20min，取出適當(dāng)冷卻后使用。

1.2 動(dòng)物及分組

C57BL/6小鼠32只，8周齡，雌雄各半，清潔級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。購入后經(jīng)普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為兩組，對照組12只，雌雄各半，每日以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；模型組20只，雌雄各半，每日以致石飼料喂養(yǎng)。兩組小鼠分別于喂養(yǎng)4周和8周后，各取一半數(shù)量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術(shù)取材作相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 小鼠存活率測定

飼養(yǎng)過程中記錄各組小鼠存活情況，計(jì)算存活率。

1.4 膽囊膽固醇結(jié)石觀測

各組分別取膽囊，在顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶形成情況；抽取膽囊膽汁，1000rpm離心后取沉渣在顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定結(jié)石性質(zhì)[5-6]。

1.5 血脂測定

經(jīng)心臟穿刺抽血，分離血漿后采用CX-7型全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman）測定血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）濃度。

1.6 膽囊膽汁膽固醇飽和度測定

抽取膽囊膽汁，離心去除膽固醇結(jié)晶，經(jīng)適當(dāng)稀釋后在全自動(dòng)生化分析儀上測定膽汁總膽固醇、磷脂和總膽汁酸，通過Carey表[7]計(jì)算膽固醇飽和指數(shù)（cholesterol saturation index，CSI）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠存活情況

對照組小鼠在8周飼養(yǎng)過程中全部存活，存活率100%。模型組小鼠在飼養(yǎng)過程中死亡1只，存活率95%。

2.2 成石情況

對照組4周和8周膽囊內(nèi)膽汁澄清，皆未見結(jié)石結(jié)晶形成（圖1-A，圖2-A），成石率為零。模型組4周時(shí)即見膽囊內(nèi)膽汁渾濁，10只小鼠中有8只可見結(jié)石結(jié)晶形成，成石率為80%，8周時(shí)剩余9只全部檢測到結(jié)石，成石率為100%（圖1-B，圖2-B），紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定為膽固醇結(jié)石。

A 對照組膽囊

B 模型組膽囊

A 對照組膽汁

B 模型組膽汁

2.3 各組血脂測定結(jié)果

兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血脂水平見表2。與對照組比較，模型組4周和8周TC濃度顯著升高（P<0.01）；模型組8周與4周時(shí)比較無顯著差異（P>0.05），說明模型組4周時(shí)血液總膽固醇濃度已處于較高水平，繼續(xù)致石飼料飼養(yǎng)并不能進(jìn)一步顯著增高總膽固醇濃度。與對照組比較，模型組4周和8周TG濃度輕度升高（P<0.05），升高幅度小于TC。與對照組比較，模型組4周和8周HDL-C顯著降低（P<0.01），而LDL-C顯著升高（P<0.01）。

2.4 CSI測定結(jié)果

對照組小鼠4周和8周時(shí)CSI分別為0.48±0.29和0.58±0.21，皆小于1，說明膽固醇處于未飽和狀態(tài)。模型組小鼠4周和8周時(shí)CSI分別為1.36±0.36和1.52±0.37，皆大于1，說明膽固醇濃度處于過飽和狀態(tài)。

3 討論

建立理想的膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型是研究膽石成因及其防治的重要手段。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的方法[8-11]，但尚無統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的方法。理想的動(dòng)物模型要求動(dòng)物獲取方便、造模方法簡單、成石率高、可重復(fù)性好和動(dòng)物死亡率低等。我們在借鑒文獻(xiàn)介紹方法的基礎(chǔ)上，成功建立了C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型。我們的結(jié)果表明，該造模方法具有簡單、實(shí)用、成石率高及動(dòng)物存活率高等優(yōu)點(diǎn)。endprint

對于造模動(dòng)物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動(dòng)物[8-10]。相對于其他動(dòng)物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價(jià)格低廉、獲取方便，同時(shí)針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的關(guān)鍵因素[8-12]。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們綜合文獻(xiàn)介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎(chǔ)飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實(shí)驗(yàn)小鼠不愿進(jìn)食或進(jìn)食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質(zhì)地偏硬、油脂味較重，導(dǎo)致小鼠咬食困難或不愿意進(jìn)食等因素有關(guān)。在本研究中，我們?nèi)コ孙暳现蟹潜仨毘煞郑⒔档土素i油與膽酸的濃度；同時(shí)，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進(jìn)食量明顯增多。本研究結(jié)果表明，該配方簡單，成石率高，動(dòng)物存活率較高，8周造模完成時(shí)存活率達(dá)95%。

高脂物質(zhì)的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結(jié)石形成過程中的重要環(huán)節(jié)之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現(xiàn)了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時(shí)，脂蛋白濃度亦出現(xiàn)了相應(yīng)的改變。在膽固醇結(jié)石形成機(jī)制中，目前認(rèn)為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結(jié)石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實(shí)驗(yàn)組小鼠膽固醇飽和指數(shù)大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質(zhì)形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導(dǎo)致膽固醇結(jié)石形成，有效地模擬了人膽固醇結(jié)石的形成過程，不失為研究膽固醇結(jié)石形成機(jī)制及防治的較好模型。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-12-10）endprint

對于造模動(dòng)物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動(dòng)物[8-10]。相對于其他動(dòng)物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價(jià)格低廉、獲取方便，同時(shí)針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的關(guān)鍵因素[8-12]。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們綜合文獻(xiàn)介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎(chǔ)飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實(shí)驗(yàn)小鼠不愿進(jìn)食或進(jìn)食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質(zhì)地偏硬、油脂味較重，導(dǎo)致小鼠咬食困難或不愿意進(jìn)食等因素有關(guān)。在本研究中，我們?nèi)コ孙暳现蟹潜仨毘煞郑⒔档土素i油與膽酸的濃度；同時(shí)，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進(jìn)食量明顯增多。本研究結(jié)果表明，該配方簡單，成石率高，動(dòng)物存活率較高，8周造模完成時(shí)存活率達(dá)95%。

高脂物質(zhì)的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結(jié)石形成過程中的重要環(huán)節(jié)之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現(xiàn)了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時(shí)，脂蛋白濃度亦出現(xiàn)了相應(yīng)的改變。在膽固醇結(jié)石形成機(jī)制中，目前認(rèn)為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結(jié)石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實(shí)驗(yàn)組小鼠膽固醇飽和指數(shù)大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質(zhì)形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導(dǎo)致膽固醇結(jié)石形成，有效地模擬了人膽固醇結(jié)石的形成過程，不失為研究膽固醇結(jié)石形成機(jī)制及防治的較好模型。

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（收稿日期：2013-12-10）endprint

對于造模動(dòng)物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動(dòng)物[8-10]。相對于其他動(dòng)物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價(jià)格低廉、獲取方便，同時(shí)針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的關(guān)鍵因素[8-12]。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們綜合文獻(xiàn)介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎(chǔ)飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實(shí)驗(yàn)小鼠不愿進(jìn)食或進(jìn)食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質(zhì)地偏硬、油脂味較重，導(dǎo)致小鼠咬食困難或不愿意進(jìn)食等因素有關(guān)。在本研究中，我們?nèi)コ孙暳现蟹潜仨毘煞郑⒔档土素i油與膽酸的濃度；同時(shí)，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進(jìn)食量明顯增多。本研究結(jié)果表明，該配方簡單，成石率高，動(dòng)物存活率較高，8周造模完成時(shí)存活率達(dá)95%。

高脂物質(zhì)的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結(jié)石形成過程中的重要環(huán)節(jié)之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現(xiàn)了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時(shí)，脂蛋白濃度亦出現(xiàn)了相應(yīng)的改變。在膽固醇結(jié)石形成機(jī)制中，目前認(rèn)為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結(jié)石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實(shí)驗(yàn)組小鼠膽固醇飽和指數(shù)大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質(zhì)形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導(dǎo)致膽固醇結(jié)石形成，有效地模擬了人膽固醇結(jié)石的形成過程，不失為研究膽固醇結(jié)石形成機(jī)制及防治的較好模型。

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[6] 安國順，王海梅，巴圖烏拉，等. C57BL/6小鼠膽結(jié)石形成中固醇載體蛋白2的mRNA水平和膽固醇飽和指數(shù)增高[J]. 基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)，2006，26（10）：1108-1111.

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（收稿日期：2013-12-10）endprint