王強(qiáng)強(qiáng)+莫海飛+董靜+張利+伍紅

摘要：為了能夠選育出一株高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株，采用微波對(duì)其孢子懸液進(jìn)行不同時(shí)間的輻照處理后，篩選出一株能高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株B40 1，在最適產(chǎn)酶條件下，該突變菌株所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力分別是出發(fā)菌株的169.9%、110.0%。

關(guān)鍵字：里氏木霉；纖維素酶；微波誘變；酶活力

中圖分類號(hào)：S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-273x（2014）03-0005-03

纖維素是地球上最豐富且最廉價(jià)的可再生資源之一，棉、木、麻及各種秸稈中均含有豐富的纖維素。目前已經(jīng)得到的纖維素酶仍不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，所以尋找新的適于再生能源需要的高催化活性、低成本的纖維素酶，依舊是此后的研究熱點(diǎn)[1 3]。尋找和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶新菌種，選育出纖維素酶高產(chǎn)優(yōu)良菌株是纖維素資源能否高效利用的關(guān)鍵問題，也是今后纖維素酶高產(chǎn)菌選育研究的一項(xiàng)重要任務(wù)，具有非常重要的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義[4 7]。

微波是一種高頻電磁波，能夠?qū)σ恍O性分子如水分子、蛋白質(zhì)、核苷酸、碳水化合物等產(chǎn)生快速震動(dòng)的刺激作用，使細(xì)胞內(nèi)DNA分子氫鍵和堿基堆積化學(xué)力受到損傷，引起DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)生遺傳變異[8]。本試驗(yàn)以里氏木霉Rutc30為出發(fā)菌株，經(jīng)微波輻照處理，最終選育出一株高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉突變菌株B40 1。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 里氏木霉菌株（TrichodermareeseiRutc30），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要儀器 ODELGSKP 01BII型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；HZQ CV型空氣振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）；UV 6100型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；家用微波爐（額定輸出功率800 W，脈沖頻率2450 MHz）；ST16R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Thermo（德國）。

1.1.3主要試劑 ①DNS試劑：3，5 二硝基水楊酸5.3 g，NaOH 9.9 g，酒石酸鉀鈉153 g，無水亞硫酸鈉4.15 g，苯酚3.8 mL，蒸餾水708 mL；②葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取葡萄糖0.036 g，蒸餾水定容至100 mL；③0.05 mol/mL，pH 4.8的檬酸 檸檬酸鈉緩沖液：無水檸檬酸9.6 g，無水檸檬酸鈉16.1186 g，蒸餾水定容至100 mL等。

1.1.4培養(yǎng)基 ①土豆培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡萄糖2 g，瓊脂2 g，自來水定容至100 mL，pH自然；②分離培養(yǎng)基：KH2PO4 0.100 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，（NH4）2SO4 1.000 g，CMC Na 1.000 g，去氧膽酸納0.250 g，剛果紅0.020 g，瓊脂2.000 g，蒸餾水定容至100 mL，pH自然；③MM培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 5.0 g，KH2PO415 g，MgSO4·7H2O20.6 g，CaCl2 0.453 1 g，CoCl2·6H20 3.7mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O1.4mg，MnSO4·H2O1.6mg，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6支10 mL試管，分別加入相應(yīng)試劑，于沸水浴中顯色5 min，取出后用冰水迅速冷卻，加入蒸餾水至5 mL，搖勻靜置，于540 nm波長處測(cè)定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.2菌株的活化、培養(yǎng)與孢子懸液制備 刮取冷凍里氏木霉菌絲少許，轉(zhuǎn)至盛有0.85%生理鹽水的試管內(nèi)，40 ℃水浴振蕩復(fù)蘇100 s；吸取適量菌液平板涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d；用pH為7.0的磷酸緩沖液沖洗下孢子，180 r/min，30℃恒溫振蕩30 min，使孢子充分活化并分散；用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后用相同濃度的生理鹽水將孢子懸液稀釋至106個(gè)/mL[8 11]。

1.2.3微波誘變 微波爐調(diào)至最大功率800 W，額定頻率2 450 MHz。按不同的輻照時(shí)間對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行處理后，冰水浴1 min以消除微波熱效應(yīng)，取輻照后的孢子懸液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)5d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)計(jì)算微波不同輻照時(shí)間下的致死率[8，12]。致死率=（對(duì)照菌落數(shù) 處理菌落數(shù)）/對(duì)照菌落數(shù)×100%。

1.2.4突變菌株的篩選及擴(kuò)大培養(yǎng) 篩選培養(yǎng)5 d后，挑選透明圈與菌落直徑之比大于2.0（H/C>2.0）、生長較快且產(chǎn)孢豐滿的菌落，接種到MM培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。稱取菌絲1 g（濕重）接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)5 d。取適量培養(yǎng)液于4 ℃，6 000 r/min離心10 min，將上清液移至新的EP管中，備用[8，13 15]。

1.2.5纖維素酶活力測(cè)定 ①取適量原菌株酶液，沸水浴中處理5 min，為對(duì)照組備用；②FPA活力測(cè)定：將新華濾紙裁成6 cm×1 cm的長方形，卷成圓筒狀置于50 mL試管中，加入0.05 mol/mL、pH 4.8的檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液1.5 mL，加酶液0.5 mL（空白先不加），50℃水浴平衡60 min后，加3 mLDNS試劑，沸水浴10 min后冰水中迅速冷卻，補(bǔ)加蒸餾水至25 mL，搖勻靜置，于540 nm處測(cè)吸光值。③羧甲基纖維素酶活力測(cè)定：在50 mL試管中先各加入1%CMC溶液0.5 mL，再加入0.5 mL酶液（空白先不加），50 ℃保溫30 min后，加入2.0 mLDNS試劑，水浴煮沸5min，冰水迅速冷卻后加蒸餾水至10 mL，混勻靜置，在540 nm處測(cè)OD值[9，15]。

纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時(shí)水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測(cè)定。

2.2微波對(duì)里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發(fā)菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對(duì)其孢子懸浮液進(jìn)行輻照處理，輻照時(shí)間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時(shí)間關(guān)系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產(chǎn)酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養(yǎng)基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號(hào)后對(duì)其搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定突變菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產(chǎn)酶性能，結(jié)果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發(fā)菌株，相對(duì)FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測(cè)定結(jié)果，最終選育出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株B40 1。其相對(duì)FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結(jié)與討論

通過本試驗(yàn)，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運(yùn)用冰水浴法，對(duì)輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻射時(shí)間為20 s時(shí)，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對(duì)微波極為敏感，同時(shí)確定微波誘變的最佳時(shí)間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力達(dá)到3.061 U，是原出發(fā)菌株所產(chǎn)纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機(jī)理有待進(jìn)一步的探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2005，17（5）：392 397.

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[14] 伍 紅，秦天鶯，譚德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2008，30（6）：620 624.

[15] 張瑞萍.纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測(cè)定[J].印染助劑，2002，19（5）：52 53.

纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時(shí)水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測(cè)定。

2.2微波對(duì)里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發(fā)菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對(duì)其孢子懸浮液進(jìn)行輻照處理，輻照時(shí)間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時(shí)間關(guān)系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產(chǎn)酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養(yǎng)基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號(hào)后對(duì)其搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定突變菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產(chǎn)酶性能，結(jié)果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發(fā)菌株，相對(duì)FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測(cè)定結(jié)果，最終選育出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株B40 1。其相對(duì)FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結(jié)與討論

通過本試驗(yàn)，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運(yùn)用冰水浴法，對(duì)輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻射時(shí)間為20 s時(shí)，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對(duì)微波極為敏感，同時(shí)確定微波誘變的最佳時(shí)間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力達(dá)到3.061 U，是原出發(fā)菌株所產(chǎn)纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機(jī)理有待進(jìn)一步的探討。

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[14] 伍 紅，秦天鶯，譚德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2008，30（6）：620 624.

[15] 張瑞萍.纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測(cè)定[J].印染助劑，2002，19（5）：52 53.

纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時(shí)水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測(cè)定。

2.2微波對(duì)里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發(fā)菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對(duì)其孢子懸浮液進(jìn)行輻照處理，輻照時(shí)間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時(shí)間關(guān)系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時(shí)，致死率達(dá)81.2%，當(dāng)輻照時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為95.8%，100 s處理時(shí)，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對(duì)微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產(chǎn)酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養(yǎng)基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號(hào)后對(duì)其搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定突變菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產(chǎn)酶性能，結(jié)果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發(fā)菌株，相對(duì)FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測(cè)定結(jié)果，最終選育出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株B40 1。其相對(duì)FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結(jié)與討論

通過本試驗(yàn)，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運(yùn)用冰水浴法，對(duì)輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻射時(shí)間為20 s時(shí)，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對(duì)微波極為敏感，同時(shí)確定微波誘變的最佳時(shí)間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力達(dá)到3.061 U，是原出發(fā)菌株所產(chǎn)纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機(jī)理有待進(jìn)一步的探討。

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