（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程系，山東濟(jì)南 250100）

毛木耳[Auricularia Polytricha（Mont）Sacl.] 又稱白背毛木耳，屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬中的毛木耳種。毛木耳富含蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)元素和維生素，背面的絨毛中含有豐富的多糖，據(jù)研究表明毛木耳多糖具有提高免疫力[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗凝血、抗血栓、降血脂[4]等作用。

在目前的研究中以黑木耳多糖的研究居多，對毛木耳多糖提取工藝的研究相對較少，但毛木耳產(chǎn)地分布廣泛，產(chǎn)量豐富，目前對毛木耳的開發(fā)和利用仍停留在初級加工的水平，即產(chǎn)品形式多為干鮮品，產(chǎn)品價格低廉。為提高毛木耳的附加值，開發(fā)精深加工產(chǎn)品，目前大多采用熱水浸提法提取多糖類物質(zhì)[5]。近年來，微波技術(shù)的應(yīng)用得到很大發(fā)展。微波具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)，應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，可有效提高收率[6-8]。超微粉碎也是一項高新技術(shù)，可將原物料粉碎到10 μm～25 μm左右，在該細(xì)度條件下，一般物料細(xì)胞破壁率＞95%，采用超微粉碎通過細(xì)胞破壁使物料中的生物活性成分較好地暴露出來，而不再需要通過穿透細(xì)胞壁或細(xì)胞膜才能釋放；同時，物料微粉化后顆粒體積變小，表面積急劇增加，從而有助于提高活性成分的利用率[9-10]。

本實(shí)驗為提高毛木耳中多糖的得率，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對微波輔助提取毛木耳超微粉中多糖的工藝進(jìn)行研究，為毛木耳的進(jìn)一步開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

毛木耳：采自山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗基地。

1.1.2 主要試劑

濃硫酸、苯酚、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

WF-20型萬能粉碎機(jī)：江陰耐馳機(jī)械科技有限公司；ND7-2L型球磨粉碎機(jī)：南京南大天尊電子有限公司；WZJ-6J型振動式超細(xì)粉碎機(jī)：濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司；XO-SM200超聲波微波組合系統(tǒng)（超聲波頻率25 KHz，功率0 W～1 000 W；微波頻率2 450 MHz，功率50 W～1 000 W）：南京先歐儀器制造有限公司；TGL16臺式高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV2000分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；KH-6HMTN2型微波干燥機(jī)：山東科弘微波能有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超微粉的制備

原料毛木耳→萬能粉碎機(jī)→一級毛木耳粗粉碎（細(xì)度40目左右）→球磨機(jī)→過篩得到粗粉（平均100目）→超細(xì)粉碎振動磨→超微粉（95%以上過300目的毛木耳超微粉）

1.2.2 多糖提取工藝

準(zhǔn)確稱取300目超微粉，在一定的條件下經(jīng)超聲波微波組合系統(tǒng)中的微波功能提取毛木耳超微粉多糖，提取液先定容，再離心，然后取上清液進(jìn)行測定。

1.2.3 毛木耳超微粉多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定毛木耳超微粉多糖的含量[11]。

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中加水至刻度即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。以2.0 mL蒸餾水作為空白在10個樣品中加入6%的苯酚1mL和濃硫酸5mL。靜置10min后搖勻，室溫放置20 min，然后在490 nm處測量樣品的吸光值。以多糖濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.046 6x+0.001 7，R2=0.9993，線性關(guān)系好。

1.2.3.2 樣品多糖含量的測定

吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品多糖含量，從而得各實(shí)驗組毛木耳超微粉多糖得率。

1.3 單因素試驗

取毛木耳超微粉1.0 g分別考察水料比、微波功率、微波時間3個單因素對毛木耳超微粉多糖得率的影響，根據(jù)試驗結(jié)果和實(shí)際情況確定響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗的因素及水平。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果分析和Box-Behnken原理，運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化毛木耳超微粉多糖的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 水料比對毛木耳超微粉多糖得率的影響

稱取1.0 g毛木耳超微粉，在微波功率為600 W，微波時間 2.0 min 的條件下，分別以 40、60、80、100、120 mL的水提取毛木耳超微粉多糖，提取后定容至250 mL，離心取上清液測定吸光度，計算多糖得率。以水料比為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)作圖。

圖1 水料比對多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of ratio of water to raw material on the extraction of polysaccharides

由圖1可知，隨水料比的增大多糖提取得率增加，由20.47%提高到25.81%，繼續(xù)增大水料比，多糖得率呈下降趨勢。當(dāng)水料比為120時，多糖得率為19.86%，比水料比為60 mL/g時的多糖得率下降了5.95%。分析原因可能為提取液過少時多糖提取不充分導(dǎo)致提取得率過低，料液比過大，提取體系物料較多，升溫慢，從而影響多糖提取得率。因此毛木耳超微粉多糖提取的水料比為60 mL/g左右時能獲得最高的提取得率。

2.1.2 微波功率對毛木耳超微粉多糖得率的影響

稱取1.0 g毛木耳超微粉，在微波時間2.0 min，水料比 60 mL/g的條件下，分別以 300、400、500、600、700、800 W的微波功率提取毛木耳超微粉多糖，定容至250 mL，離心取上清液測定吸光度，計算多糖得率。以微波功率為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)作圖。

圖2 微波功率對多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of microwave power on the extraction of polysaccharides

由圖2可知，微波功率在300 W～600 W之間時，隨微波功率的增大，多糖提取得率增加，當(dāng)功率增加到600W時，多糖得率最大，從20.64%增加到31.93%，多糖得率增加了11.29%，然后多糖得率呈明顯的下降趨勢。當(dāng)功率增加到800 W時，多糖得率為23.14%。比功率600 W時的多糖得率下降了8.79%。

2.1.3 微波時間對毛木耳超微粉多糖得率的影響

稱取1.0 g毛木耳超微粉，在微波功率600 W，水料比 60 mL/g的條件下，分別以 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min的微波時間提取毛木耳超微粉多糖，定容至250 mL，離心取上清液測定吸光度，計算多糖得率。以微波時間為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)作圖。

圖3 微波時間對多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of microwave time on the extraction of polysaccharides

由圖3可知，提取時間在1 min～2 min時，隨著處理時間的延長，多糖提取得率逐漸增大，多糖得率由23.48%增大到29.34%。這是由于處理時間過短，微波對物料細(xì)胞膜的破壞作用有限，使得多糖得率較低，隨時間的延長微波對細(xì)胞膜的破壞作用增大，多糖溶出增多，使多糖得率相應(yīng)增加，但超過2.0 min后提取得率不再增加，因此初步確定微波處理時間為2.0 min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

利用響應(yīng)曲面法研究水料比、微波功率和微波時間對毛木耳超微粉多糖得率的影響，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理，分別以A、B、C代表，每一個自變量的低中高試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼（見表1），以毛木耳超微粉多糖得率為響應(yīng)值（Y）。在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定各變量的水平范圍，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

采用三因素三水平共17個試驗點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗，其中標(biāo)準(zhǔn)序1～12組為析因試驗，13～17組為中心試驗，用來估計試驗誤差。為了避免人為因素導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，將標(biāo)準(zhǔn)序打亂，按照運(yùn)行序來進(jìn)行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

應(yīng)用Design-Expert對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到毛木耳超微粉多糖得率與所選3個因素的二次多項回歸模型為：

Y/%=-156.066 5+1.745 367A+0.329 22B+32.353 5C+7.75×10-5AB+0.071 25AC+0.021 5BC-0.015 893A2-3.144 75×10-4B2-12.269C2

式中：Y為毛木耳超微粉多糖得率；A為水料比；B為微波功率；C為微波時間。

對表2中試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，得方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of the primarily established quadric regression model

由表3可知，回歸模型的顯著水平較高，模型極顯著（P＜0.01），模型失擬度不顯著（P=0.640 4＞0.05）。模型的確定系數(shù)R2為0.915 9，表明回歸方程能夠很好地模擬真實(shí)曲面，該試驗方法是可靠的。信噪比為7.044，大于4，說明該模型擬合度和可信度均較高[11-12]。因此，可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下毛木耳超微粉多糖得率的變化。

根據(jù)表3中的方差分析結(jié)果，可見二次項A2對響應(yīng)值 Y 影響極顯著（P＜0.01）；二次項 B2、C2對響應(yīng)值Y影響顯著（P＜0.05）；其余項均不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸模型，將任一因素固定在零水平，可以得到體現(xiàn)另外兩個因素及其交互作用影響的響應(yīng)曲面圖及對應(yīng)的等高線圖[13]，見圖4～圖6。

由圖4～圖6和表3可知，模型中的水料比二次項對毛木耳超微粉多糖得率有極顯著影響，微波功率、微波時間二次項對毛木耳超微粉多糖得率有顯著影響，而水料比、微波功率、微波時間一次項和水料比和微波功率之間、水料比和微波時間之間、微波功率和微波時間之間的交互作用較小，對毛木耳超微粉多糖得率影響較小。

圖4 水料比和微波功率對多糖提取效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Responsive surface and contours of the effect of ratio of water to raw material and microwave power on the extraction of polysaccharides

圖5 水料比和微波時間對多糖提取效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Responsive surface and contours of the effect of ratio of water to raw material and microwave time on the extraction of polysaccharides

圖6 微波功率和微波時間對多糖提取效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Responsive surface and contours of the effect of microwave power and microwave time on the extraction of polysaccharides

2.2.4 毛木耳超微粉多糖提取工藝條件的確定與驗證

根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析得出毛木耳超微粉中多糖提取的最優(yōu)條件為：水料比6 0.9mL/g，微波功率599.95 W，微波時間2.02 min。在此條件下，毛木耳超微粉多糖得率的預(yù)測值為28.549%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整為：水料比60 mL/g，微波功率600 W，微波時間2.0 min。

為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件重復(fù)實(shí)驗3次，毛木耳超微粉多糖得率為平均值為28.78%，與模型理論最大值28.549%的相對誤差為0.81%，說明模型可以較好的反映出毛木耳超微粉多糖提取的條件，從而也說明了用響應(yīng)面法對毛木耳超微粉多糖提取條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化可行。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了毛木耳超微粉中多糖提取的二次多項式回歸模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠地，能夠較準(zhǔn)確的預(yù)測毛木耳超微粉中的多糖得率。

綜合考慮各方面的因素，確定微波輔助提取毛木耳超微粉中多糖的優(yōu)化條件是：水料比60 mL/g，微波功率600 W，微波時間2.0 min，此條件下毛木耳超微粉多糖的提取得率可達(dá)28.78%，與預(yù)測值的相對誤差為0.81%，證明響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取工藝科學(xué)合理，準(zhǔn)確可靠?？蔀槊径⒎鄱嗵堑纳a(chǎn)提供一定的理論參考。

[1] 鄭林用,何希德,何權(quán),等.毛木耳對小鼠免疫功能的影響研究[J] .中國食用菌,2010,29(5):43-45

[2] Song Guanglei,Du Qizhen.Isolation of a polysaccharide with anticancer activity from auricularia polytricha using high-speed countercurrent chromatography with an aqueous two-phase system[J] .Journal of Chromatography A,2010,1217(38):5930-5934

[3] Sun Yong-xu,Li Tianbao,Liu Jicheng.Structural characterization and hydroxyl radicals scavenging capacity of a polysaccharide from the fruiting bodies of auricularia polytricha[J] .Carbohydrate Polymers,2010,80(2):377-380

[4] 沈叢微,羅霞,江南,等.毛木耳多糖的藥理研究進(jìn)展[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(22):13407-13408,13411

[5] 許曉燕,余夢瑤,江南,等.用正交試驗法優(yōu)化毛木耳多糖提取工藝[J] .中國食用菌,2013,32(1):41-44

[6] Prakash Maran J,Sivakumar V,Thirugnanasambandham K,et al.Microwave assisted extraction of pectin from waste Citrullus lanatus fruit rinds[J] .Carbohydrate Polymers,2014,101:786-791

[7] Zhang Yi,Zheng Baodong,Tian Yuting,et al.Microwave-assisted extraction and anti-oxidation activity of polyphenols from lotus(Nelumbo nucifera Gaertn.)seeds[J] .Food Science and Biotechnology,2012,21(6):1577-1584

[8] Nora Pap,Sándor Beszédes,Eva Pongrácz,et al.Microwave-Assisted Extraction of Anthocyanins from Black Currant Marc[J] .Food and Bioprocess Technology,2013,6(10):2666-2674

[9] Ying Zhu,Ying Dong,Xiwen Qian,et al.Effect of superfine grinding on antidiabetic activity of bitter melon powder[J] .International Journal of Molecular Sciences,2012,13(11):14203-14218

[10] Li Man,Zhang Jiahui,Zhu Kexue,et al.Effect of superfine green tea powder on the thermodynamic,rheological and fresh noodle making properties of wheat flour[J] .LWT-Food Science and Technology,2012,46(1):23-28

[11] Wang Zhanyong,Wang Chenyu,Quan Yue,et al.Extraction of polysaccharides from phellinus nigricans mycelia and their antioxidant activitiesin vitro[J] .CarbohydratePolymers,2014,99:110-115

[12] Hong Yingkai,Liu Weijuan,LI Tong,et al.Optimization of extraction of eucommia ulmoides polysaccharides by response surface methodology[J] .Carbohydrate Polymers,2013,92(2):1761-1766

[13] 彭芳剛,李綺麗,吳衛(wèi)國,等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐奶崛」に囇芯縖J] .現(xiàn)代食品科技,2013,29(6):1349-1354,1315