金英姿，王大為

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

玉米是世界三大糧食作物之一，也是我國傳統(tǒng)的農(nóng)作物，2011/2012年我國玉米總產(chǎn)量為1.89億t，其豐富的產(chǎn)量和可利用價(jià)值而受到廣泛的關(guān)注，玉米資源深加工，其開發(fā)的產(chǎn)品種類很多[1-2]，生產(chǎn)的產(chǎn)品如淀粉、淀粉糖、有機(jī)酸、氨基酸等[3]。玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是以玉米為原料進(jìn)行深加工企業(yè)的主要副產(chǎn)物，含蛋白質(zhì)高達(dá)65%，氨基酸組成獨(dú)特，其支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸等含量高，而芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸含量很低，是制備高F值寡肽的天然理想原料[4]。

玉米高F值寡肽是重要的植物蛋白肽，易于消化吸收，具有特殊的功能和生理活性，如糾正肝臟病人低支高芳病態(tài)血液模式，減輕或消除肝性腦病癥狀[5]；支鏈氨基酸具有改善負(fù)氮平衡作用，改善病人的蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況[6]；低聚肽能使機(jī)體耐力增加，對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷適應(yīng)能力提高[7]；富含亮氨酸等疏水性氨基酸的肽，可以降低血清膽固醇濃度[8]等，因此可被廣泛用于醫(yī)藥和功能食品生產(chǎn)等領(lǐng)域，應(yīng)用前景十分廣闊。

目前我國年產(chǎn)玉米蛋白粉21萬t，主要用于低值粗飼料生產(chǎn)，或自然排放，造成蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[9]。開發(fā)玉米蛋白高F值寡肽等高附加值產(chǎn)品，則可大幅度提升玉米深加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。本研究通過對(duì)玉米黃粉酶法水解，可以獲得高F值寡肽產(chǎn)品，從而提高玉米蛋白粉的生物利用價(jià)值，促進(jìn)玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，經(jīng)處理蛋白質(zhì)含量90%以上；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶：Sigama公司出品；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GB204 METTLER TOLEDO電子精密天平：梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司；HA 121-50-02型超臨界CO2萃取裝置：南通超臨界萃取有限公司；ZD-2自動(dòng)電位滴定儀：上海啟威電子有限公司；pHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；JJ-1型數(shù)顯電動(dòng)攪拌器：常州蒙特儀器制造有限公司；KDN-04D/08D凱氏定氮儀：北京眾益中和生物技術(shù)有限公司；pH-stat裝置（自制）；J2-21型離心機(jī)：常州國華電器有限公司；WF-250型萬能粉碎機(jī)：海藍(lán)深制藥機(jī)械有限公司；ZF-6050型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；754型紫外-可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；高壓液相色譜儀：日本島津公司；835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

酶活力測定采用Folin－酚試劑法[10]。

1.3.2 水解物中氨基氮的測定

水解物中氨基態(tài)氮的測定用甲醛電位滴定法測定[11]。吸取含氨基酸約20 mg的樣品溶液于100 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20 mL置于200 mL燒杯中，加水60 mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液至酸度指示劑指示8.2。加入10 mL甲醛溶液，混勻。再用上述NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，記錄NaOH消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V1）。

同時(shí)取80 mL蒸餾水置于另一潔凈燒杯中，先用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至pH8.2（此時(shí)不計(jì)耗堿量），再加入10 mL甲醛溶液，用0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V2），作為試劑空白試驗(yàn)。

式中：V1為水解液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為空白試驗(yàn)中加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，（mol/L）；M為測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g；0.014 0為氮的毫摩爾質(zhì)量，（g/mmol）。由于氨基氮的含量與耗堿量成正比，所以用耗堿量來間接反映氨基氮的含量大小。

1.3.3 水解度的測定

水解度的測定采用pH-stat法[12-13]。

1.3.4 工藝流程

玉米蛋白粉→控制酶解成酶解液→滅酶→離心分離→去芳香族氨基酸→脫鹽→濃縮→干燥→高F值寡肽

1.3.5 試驗(yàn)操作過程

以堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉后的水解液（離心后的上清液）為底物，在一定的溫度下保溫10 min，用4 mol/L HCl調(diào)pH，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液加熱至90℃，保溫10 min進(jìn)行滅酶，迅速冷卻到室溫，離心機(jī)4 000 r/min分離15 min，得上清液；用活性炭吸附芳香族氨基酸2 h，離心10 min（3 000 r/min）取上清液；將上清液脫鹽（采用陰陽離子交換樹脂），濃縮干燥即得玉米高F值寡肽[14-15]。

1.3.6 木瓜蛋白酶酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 溫度對(duì)耗堿量的影響

取堿性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH7.0、木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解時(shí)間3.5 h，分別考察溫度為40、45、50、55、60℃時(shí)耗堿量的變化情況。

1.3.6.2 時(shí)間對(duì)耗堿量的影響

取堿性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH 7.0、木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解溫度為55℃，分別考察時(shí)間為2.5、3.5、4.5 h時(shí)耗堿量的變化。

1.3.6.3 酶添加量對(duì)耗堿量的影響

取堿性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH7.0、溫度為55℃、水解時(shí)間3.5 h，分別考察木瓜蛋白酶的酶添加量為2、3、4、5 g/100 g時(shí)耗堿量的變化。

1.3.6.4 pH對(duì)耗堿量的影響

取堿性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，水解溫度為55℃。木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解時(shí)間3.5 h，分別考察pH為6.5、7.0、7.5時(shí)耗堿量的變化情況。

1.3.7 木瓜蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)，選擇對(duì)影響玉米蛋白水解的4個(gè)因素：溫度（A）、時(shí)間（B）、酶添加量（C）和pH（D），設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以耗堿量為考察指標(biāo)，對(duì)木瓜蛋白酶水解玉米蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。見表1。

表1 木瓜蛋白酶L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1Designation of L9（34）orthogonal test on pepsin protease

1.3.8 F值的測定

采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定支鏈氨基酸（BCAA：Leu、Ile、Val）和芳香族氨基酸（AAA：Tyr、Phe）的含量，根據(jù)所得的數(shù)據(jù)按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶水解的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過正交試驗(yàn)，確定了木瓜蛋白酶水解的最適溫度、時(shí)間、酶添加量和pH，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 木瓜蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Analysis of orthogonal test results of pepsin protease

通過極差分析，可知各因素對(duì)木瓜蛋白酶酶解影響的主次關(guān)系為A＞D＞C＞B，在4個(gè)因素中，溫度對(duì)水解度的影響最大，時(shí)間的影響最小，最佳組合為A3B2C3D2，即水解條件為溫度為55℃，時(shí)間3.5 h，酶添加量為4.0 g/100 g，pH7.0。而正交表中最佳試驗(yàn)號(hào)為6號(hào)，進(jìn)行A3B2C3D2驗(yàn)證重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得此條件下消耗NaOH溶液的量為2.72 mL。

2.2 玉米高F值寡肽的氨基酸組成

經(jīng)高效液相色譜和氨基酸成份分析測定寡肽分子量在200 Da～1 000 Da之間，制得的高F值寡肽中氨基酸的種類及含量見表3。

表3 高F值寡肽混合物氨基酸的種類和含量Table 3 Components and content of amino acid in high fischer ratio oligo-peptide mg/100 mL

由表3可知，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸含量較高，而苯丙氨酸和酪氨酸含量較低。制得的高F值寡肽中BCAA的含量為391.25 mg/100 mL，AAA含量很低，BCAA與AAA的比值即F值大于20，產(chǎn)品符合高F值寡肽的要求。

3 結(jié)論

確定了木瓜蛋白酶的較佳水解條件即溫度為55℃，時(shí)間3.5 h，酶添加量為4.0 g/100 g，pH7.0，在此條件下消耗的NaOH溶液的體積為2.72 mL。通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解玉米蛋白粉制得的玉米高F值寡肽，分子量在200 Da～1 000 Da之間，F(xiàn)值大于20，符合產(chǎn)品質(zhì)量要求。

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