宋海，吳冬青，安紅鋼，林敏，任雪峰，*

（1.河西學院化學化工學院，甘肅張掖734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖734000）

茵陳（Artemisia Capillaris Herba）為菊科植物濱蒿（Artemisia scoparia Waldst.et Kit.）或茵陳蒿（Artemisia capillaris Thunb.）的干燥地上部分[1]，又名白蒿、絨蒿、松毛艾、豬毛蒿等。其化學成分主要包括有機酸類、香豆素類、色原酮類[2]及揮發(fā)油[3]等。茵陳是一種常用的中藥，其味辛、苦，性微寒，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，具有清濕熱、退黃疸、改善肝功能，提高谷草轉氨酶（GOT）、谷-丙轉氨酶（GPT）等水平作用的功效，臨床上主要用于黃疸尿少，濕瘡瘙癢和傳染性黃疸型肝炎的治療[1]。試驗以茵陳總黃酮的提取率為考察指標，以分光光度法對其進行測定，優(yōu)選茵陳總黃酮的最佳提取工藝，以其為茵陳總黃酮提取的生產(chǎn)工藝提供參考。

1 原料、試劑與方法

1.1 原料及處理方法

茵陳：2011年3月采自張掖市甘州區(qū)大滿鎮(zhèn)馬均村東部沙漠邊緣。

原料處理方法：將茵陳經(jīng)自來水、蒸餾水洗凈后晾干，放入烘箱（50℃）烘干至恒重，粉碎后過60目篩，備用。

1.2 主要試劑

蘆?。海≧utin）國藥集團化學制劑有限責任公司（上海），批號：F20040304。95%乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

1.3 主要儀器

WFJ2100型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；GB204電子天平、Pipet-One移液器（100 μL～1 000 μL）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 茵陳總黃酮提取液的制備

精確稱取0.500 0 g茵陳干粉于100 mL的圓底燒瓶中，以一定濃度和一定體積的乙醇作溶劑，在一定的提取溫度和時間下回流提取，過濾。提取3次后，收集濾液，定容至100 mL的容量瓶中，待測。

1.4.2 單因素試驗

分別以提取溫度、乙醇濃度、提取時間和料液比為影響因素，設置各因素的不同水平，以確定相關因素對茵陳提取液中總黃酮提取率的影響。

1.4.3 響應面試驗

為了獲得最佳的工藝條件，根據(jù)中心組合設計原理，結合響應面分析法，綜合單因素試驗結果以料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間4個因素為自變量，茵陳總黃酮提取率為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗，利用響應面的試驗結果，確定茵陳中總黃酮的最佳提取工藝條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels code of response surface

1.4.4 蘆丁標準曲線的繪制

1.4.4.1 蘆丁標準溶液的配制

準確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.0500g，用75%乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，搖勻。得濃度為0.500 0（mg/mL）蘆丁標準溶液。

1.4.4.2 標準曲線的繪制

準確移取濃度為0.500 0 mg/mL蘆丁標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，分別置于 10mL具塞試管中，加入5%NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，放置6 min后；加入10%Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻，再放置6 min；然后加4%NaOH溶液5.00 mL，用75%乙醇定容，搖勻，放置10 min后，在510 nm處測定吸光度（以試劑空白為參比），以蘆丁體積（V）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.4.5 茵陳總黃酮提取率的測定

以蘆丁試劑空白為參比，依1.4.4.2方法測定吸光度值，總黃酮提取率按下式計算：

2 結果與分析

2.1 標準曲線

按照1.4.4.2的實驗方法，以樣品體積V（mL）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁體積在0.00～3.00 mL范圍內蘆丁標準溶液濃度與吸光度之間有較好的線性相關性，回歸直線方程：A=0.002 07+0.618 6V，R2=0.999 54。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對黃酮提取率的影響

精確稱取0.500 0 g茵陳干粉，固定乙醇濃度為50%，提取時間為 2 h，料液比為 1 ∶50（g/mL），考察提取溫度在 30、40、50、60、70、80、90 ℃范圍內對茵陳總黃酮提取率的影響，見圖2。

圖2 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extract temperature on extraction yield of total flavonoids

從圖2可以看出，隨著溫度的升高，吸光度不斷增加，但當溫度達到70℃后，吸光度開始減小，一直呈下降趨勢，這是因為溫度升高，分子運動速度加快,滲透、擴散、溶解速度加快，黃酮類化合物更易從細胞中轉移到溶劑中，使黃酮類化合物的得率隨提取溫度的升高而提高，當溫度升高到一定程度時,黃酮類化合物被氧化破壞而導致其得率下降[4-5]。因此，選擇提取溫度為70℃。

2.2.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

精確稱取0.500 0 g茵陳干粉，固定提取溫度為70 ℃，提取時間為 2 h，料液比為 1∶50（g/mL），考察乙醇濃度在 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的范圍內對茵陳總黃酮提取率的影響，見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

從圖3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，吸光度不斷增加，乙醇濃度在70%時的吸光度最大，隨后逐漸減小。這可能由于茵陳中黃酮類化合物多為水溶性和醇溶性物質，具有較強的極性，根據(jù)相似相溶原理，在乙醇濃度為70%時，醇溶性和水溶性的黃酮類物質都能最大程度的溶出，而乙醇濃度超過70%時，水溶性黃酮溶出量大幅度減少故黃酮提取率下降。所以在乙醇濃度為70%時其吸光度達到最大，故選擇乙醇濃度為70%。

2.2.3 料液比對黃酮提取率的影響

精確稱取0.500 0 g茵陳干粉，固定提取溫度為70℃，提取時間為2h，乙醇濃度為70%，考察料液比在 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70和 1∶80的范圍內對茵陳總黃酮提取率的影響，見圖4。

由圖4可知，在料液比為1∶60時，總黃酮的提取率達到最大，可能原因是在1∶60之前隨著溶劑和溶質的接觸面積慢慢增大，茵陳總黃酮的提取量也增大，在1∶60之后，由于溶劑過多，溶劑和溶質的接觸面積慢慢減小，隨之提取量也減小，因此，選擇料液比為 1∶60。

2.2.4 提取時間對黃酮提取率的影響

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

精確稱取0.500 0 g茵陳干粉，固定提取溫度為70℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶60，考察提取時間在 0.25、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5 h 的范圍內對茵陳總黃酮提取率的影響，結果如圖5所示。

圖5 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extract time on extraction yield of total flavonoids

由圖5可知，隨著提取時間增加，總黃酮的提取率不斷增加，在1 h時達到最大值，之后增幅逐漸較小。從提取效果和時間效益考慮，選擇最佳提取時間為1 h。

2.3 響應面試驗

以料液比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度為自變量，茵陳總黃酮提取率為響應值（Y），進行響應面分析試驗。試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

續(xù)表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

采用Design-expert 7.1.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，建立多元二次響應面回歸模型：

2.3.1 方差分析

各因素的方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis of extraction rate of total flavonoids of Artemisia Capillaris Herba

由表3知，模型的“Prob＞F”值小于 0.000 1，表明二次方程擬合極其顯著，失擬項F值為3.42，表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的，而不顯著的失擬項才可用。提取時間（X3）的“Prob＞F”值小于 0.000 1，表明其對茵陳總黃酮提取率影響及其顯著，料液比（X1）、乙醇濃度（X2）和提取溫度（X4）的“Prob＞F”值小于0.01，表明其對茵陳總黃酮提取率影響較為顯著。決定系數(shù)R2=0.938 2，CV值為2.81%，說明模型擬合好，實驗誤差小，實驗操作可信，可用此模型對茵陳總黃酮提取率進行分析和預測[6-7]，且影響茵陳總黃酮提取率的各因素按影響大小排序依次為提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度。二次項 X12、X22、X32和 X42影響極顯著，其它不太顯著，表明各因素對總黃酮提取率不是簡單線性關系。各交互因素響應曲面圖如圖6，可以看出同樣的結果。

2.3.2 驗證試驗

圖6 各因素對茵陳中總黃酮提取率影響的三維響應曲面圖Fig.6 Response surface for the effects of variables on the rate of the total flavonoids from Artemisia Capillaris Herba

通過回歸模型預測的茵陳總黃酮提取最佳工藝條件為料液比1∶72.9，乙醇濃度為76.6%，提取時間為1.685 h，提取溫度為73.5℃，在此條件下，茵陳總黃酮提取率理論上可達7.962%?？紤]到實際操作的可行性，將茵陳總黃酮的最佳提取條件在理論值基礎上修正為料液比為1∶73，乙醇濃度為77%，提取時間為1.68 h（100 min），提取溫度為 71℃，采用此工藝條件進行驗證實驗，平行3組。測得的茵陳總黃酮提取率分別為7.893%、7.935%和7.932%，茵陳總黃酮提取率的平均值為7.920%，相對誤差為0.53%，說明采用響應面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實際價值。

3 結論

響應面分析法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法，它克服了正交設計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和相應值的最優(yōu)值的缺陷[8]。采用響應曲面分析中的Box-Behnken模式，對茵陳總黃酮提取工藝條件進行了優(yōu)化，并得出最佳工藝參數(shù)。試驗結果表明，模型擬合程度高，試驗誤差小，可用于實際預測。優(yōu)化的工藝條件為：料液比1∶73，乙醇濃度為77%，提取時間為1.68 h，提取溫度為71℃，在此條件下，茵陳總黃酮理論提取率為7.962%，實際得率為7.962%，優(yōu)化得到的預測結果與實際結果吻合較好。說明采用響應面法優(yōu)化得到的茵陳總黃酮提取工藝準確。

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