劉剛，姜唯唯，吳京，張曉喻，*，范輝建，張宏

（1.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610101；2.四川師范大學植物資源應用與開發(fā)研究所，四川成都610101；3.攀枝花市銳華農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責任公司，四川攀枝花 617000）

抗氧化活性與生物的抗病性、抗逆性及延緩衰老等密切相關[1]，常見的癌癥、動脈硬化、糖尿病、心血管病、老年癡呆、關節(jié)炎等疾病與自由基的作用相關[2-3]，機體適當補充外源性抗氧劑或給予能促使機體內(nèi)源性抗氧化物恢復的藥物，可改善機體的正常功能[4]。

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹科植物[5]，《中藥大辭典》記載：芒果葉味酸、甘，性涼，行氣疏滯，去痧積；治熱滯腹痛、氣脹；并洗爛瘡；提取物有抑菌及雌性激素樣作用[6]?，F(xiàn)代臨床應用表明芒果葉具有平喘止咳、免疫、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤等作用[7-8]，國內(nèi)外研究表明，芒果及其附屬物含有黃酮類、酚類等物質(zhì)，而酚類物質(zhì)具有高抗氧化活性及清除自由基等生物功能[9]。Sato[10]等研究芒果苷抗氧化活性的作用機理時發(fā)現(xiàn)，其具有快速清除DPPH的能力。Pitchaon[11]等對芒果核仁的抗氧化性進行了研究，認為芒果核仁總酚含量高，具有最強的清除自由基的能力，產(chǎn)品對皮膚無刺激，可用于食品、化妝品、保健品及藥物領域。Ajila[12]以芒果皮為原料進行研究，發(fā)現(xiàn)其提取物可抑制大豆卵磷脂氧化產(chǎn)物的生成，有較好的抗氧化活性。陳昱潔[13]等研究了芒果果核提取物的抗氧化活性。

目前，芒果葉提取物的抗氧化活性研究尚鮮見文獻報道，且未有對DPPH自由基抗氧化的反應條件進行考察與優(yōu)化的報道。本研究以攀枝花凱特芒果葉為原料，用95%乙醇冷浸提取得到浸膏，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取浸膏，最后剩余的部分為水提部位。本實驗用DPPH法測定芒果葉各部位提取物清除自由基的能力，并對其反應條件進行考察，建立樣品最優(yōu)反應方法，綜合評價其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凱特芒果葉：攀枝花芒果基地，攀枝花市銳華農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責任公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；抗壞血酸（批號20120402）：成都市科龍化工試劑廠；芒果苷標準品、蘆丁標準品：四川省維克奇生物科技有限公司；DPPH：Sigma。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外分光光度儀：SHIMADZU；Sartorius BP211D型電子天平：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HH.W21型恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；BCD-518WS型冰箱：海爾集團。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液和DPPH溶液的制備

分別準確稱取VitC標準品、芒果苷標準品5 mg和DPPH粉末7.89mg，分別用甲醇溶解后定容至25mL，得0.2 mg/mL的VitC、芒果苷溶液以及2×10-4mol/L的DPPH溶液。溶液避光，4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 芒果葉不同部位提取物溶液的制備

將自然風干的芒果葉粉碎至200目的粉末，以95%乙醇為提取劑，采用冷浸法提取出浸膏；將浸膏分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行依次萃取，每相萃取三次，每次萃取體積比為1∶1，合并萃取液，剩余部分為水部位，四組分別減壓干燥濃縮，分別得到芒果葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位提取物。精確稱取47.5 mg石油醚和35.7 mg乙酸乙酯的萃取物，用95%乙醇溶解后定容至25 mL，得濃度分別為1.90、1.43 mg/mL供試母液。再精確稱取43.0 mg正丁醇和44.2 mg水部位的提取物，用甲醇溶解后定容至25 mL，得濃度分別為1.72、1.77 mg/mL供試母液，避光低溫保存。

1.3.3 不同部位提取物黃酮含量的測定

1.3.3.1 標準曲線的繪制

稱取10.88 mg蘆丁標準品，用50%乙醇定容于50 mL 容量瓶中。分別移取標品母液 0.1、0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，先各添加質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉水溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；然后添加質(zhì)量分數(shù)10%硝酸鋁水溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入質(zhì)量分數(shù)4%NaOH溶液4.00 mL，搖勻，用50%乙醇定容至刻度，靜置12 min，于510 nm處測定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：y=0.001 12x-0.004 81，R2=0.999 94。

1.3.3.2 黃酮含量的測定

精確稱取11.8 mg石油醚、10.5 mg乙酸乙酯萃取物，用95%乙醇溶解定容至10mL，再精確稱取12.8 mg正丁醇和13.2 mg水部位提取物，用甲醇溶解后定容至10 mL。分別精密移取不同部位提取物母液1 mL于10 mL容量瓶中，按照1.3.3.1方法在510 nm處測其吸光度值，以相應試劑為空白調(diào)零，用回歸方程計算出各極性部位的黃酮含量。

1.3.4 抗氧化測定條件的考察

1.3.4.1 測定波長的選擇

于190 nm～800 nm波長下，將DPPH溶液進行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果在330、517 nm波長處有最大吸收，由于517 nm處DPPH有特殊吸收，因此選定測定波長為517 nm。

1.3.4.2 線性范圍的考察

分別精密吸取 DPPH 溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，得不同濃度DPPH溶液，以甲醇為空白，在517nm波長處測定吸光度，每個濃度三個重復。得回歸方程：y=0.028 39x，R2=0.999 74。結(jié)果表明，DPPH溶液在0～41.400 mg/L的范圍內(nèi)有良好的線性關系。

1.3.4.3 DPPH熱穩(wěn)定性的考察

取2 mL DPPH溶液，加入甲醇2 mL，分別于20、30、40、50、60、70、80℃下避光水浴 30 min，測定其吸光度，每個溫度設3個重復，得到熱穩(wěn)定性曲線圖。

1.3.4.4 抗氧化溫度的考察

準確量取石油醚、乙酸乙酯和正丁醇供試品母液1 mL定容至100 mL，搖勻，得稀釋100倍的樣品溶液；同樣方法配制水部分50倍的樣品溶液。取2 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH溶液分別于20、30、40、50℃避光水浴反應30 min，于517 nm波長下測定吸光度（Ai）；分別精密吸取2 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL甲醇（或95%乙醇）溶液，在相同條件下測定其吸光度（Aj）；Ac為不加樣品溶液的空白對照組。

1.3.4.5 抗氧化時間的考察

四個部分萃取物的樣品溶液配制方法同1.3.4.4，設置空白對照。每個實驗組重復三次，計算各樣品不同時間的清除率，分析最佳抗氧化時間。

1.3.5 清除DPPH自由基能力的測定

清除自由基的抗氧化劑能力采用清除DPPH的半數(shù)清除率，即IC50值來表示[14-15]。指將清除率（Y）對樣品濃度（X）作圖，求其對數(shù)函數(shù)方程，根據(jù)方程求出清除率為50%時藥物的濃度，即為IC50值。IC50值越小，表明其半數(shù)清除率越高，即抗氧化劑清除自由基的能力越強[16]。

選擇考察結(jié)果中抗氧化能力最佳的溫度及時間，確定最佳方法，將供試品母液及對照品配制成不同濃度梯度，于517 nm下測定吸光度值。每個實驗重復三次。按下列公式計算自由基的清除率：

式中：Ai為2 mL樣品液+2 mL DPPH液，混合后的吸光度值；Aj為2mL樣品液+2mL溶劑，混合后的吸光度值；Ac為2 mL DPPH液+2 mL溶劑，混合后的吸光度值。

1.3.6 實驗設計與統(tǒng)計分析

按芒果葉提取部位的不同設置五個樣品溶液組，同時設定“樣品溶液-溶劑”和“DPPH溶液-溶劑”空白對照組兩個。測得吸光度后，按公式計算各樣品組的自由基清除率，依據(jù)各樣品組的清除率、各樣品組溶液質(zhì)量濃度的梯度變化關系。用SPSS17.0中PROBIT方法進行分析，計算得到各樣品組的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果葉不同極性部位黃酮含量

按照1.3.3.1方法分別測定石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等部位的提取物，以相應溶劑為空白，計算出各極性部位的黃酮含量，見圖1。

圖1 芒果葉不同極性部位提取物的黃酮含量Fig.1 Flavonoid content of different polarity fractions of extracts from mango leaves

由圖1可以看出，芒果葉不同極性部位提取物中黃酮含量具有較大的差異。含量最高的是乙酸乙酯部位，為（292.063±1.100）mg/g；含量最低的是水部位，為（21.717±1.157）mg/g。黃酮含量大小順序為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位。

2.2 測定方法的考察

由于DPPH自由基會受到時間和溫度的影響，但其在一定條件下是相對穩(wěn)定的。所以對DPPH熱穩(wěn)定性，以及樣品抗氧化溫度和時間進行考察，以得到DPPH穩(wěn)定反應的溫度范圍，建立樣品最優(yōu)反應方法。

2.2.1 DPPH的熱穩(wěn)定性

不同溫度下避光水浴30 min后，分別測定DPPH溶液的吸光度，得出其熱穩(wěn)定性曲線，見圖2。

圖2 不同溫度下DPPH溶液的熱穩(wěn)定性Fig.2 The thermal stability of the DPPH in different temperatures

從圖2可以看出，DPPH溶液在20℃～50℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，對應的濃度平均為：（30.007±0.169）mg/L。而60℃～80℃明顯下降，濃度平均值從（27.627±0.008）mg/L降到（22.222±0.563）mg/L。表明DPPH溶液在20℃～50℃范圍較穩(wěn)定，故將測試的溫度設定在此范圍。

2.2.2 測定的溫度

按照1.3.4.4項的方法，得出不同樣品溶液在20℃～50℃的清除率，見圖3。

圖3 芒果葉不同極性部位提取物在不同溫度下的清除率Fig.3 The scavenging percentage of different polarity fractions of extracts from mango leaves in different temperatures

由圖3可以看出，芒果葉石油醚和乙酸乙酯萃取物在20℃～50℃范圍內(nèi)對DPPH自由基清除率，均在50℃時清除率最高。所以選擇50℃為兩部分萃取物反應最佳溫度。芒果葉正丁醇萃取物此范圍內(nèi)清除率相差不大，其中30℃時清除率為最高，可選擇30℃為此部分萃取物反應溫度；芒果葉水部位在40℃時清除率為最高，所以此部分反應的溫度選擇40℃。

在DPPH熱穩(wěn)定范圍內(nèi)，石油醚和乙酸乙酯萃取物對DPPH的清除能力均隨著溫度的升高而增加，正丁醇和水部位提取物達到最高值后略微有所下降，但相差不大。

2.2.3 反應的時間

不同樣品溶液于較好的反應溫度條件下，不同反應時間的清除率，結(jié)果見圖4。

圖4 芒果葉不同極性部位提取物在不同時間下的清除率Fig.4 The scavenging percentage of different polarity fractions of extracts from mango leaves in different times

從圖4可以看出，芒果葉石油醚、正丁醇萃取物以及水部位提取物在各自最佳反應溫度下均以20 min時的樣品清除率最高，所以選擇20 min為此三種提取物的最佳反應時間；而乙酸乙酯萃取物的最佳反應時間為30 min。

2.3 芒果葉提取物清除DPPH自由基的能力

根據(jù)已經(jīng)確定的反應溫度、時間，對芒果葉的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位提取物進行DPPH自由基清除率的測定，并與芒果苷、抗壞血酸標準品進行比較，結(jié)果見圖5。

圖5 芒果葉不同極性部位提取物對DPPH的清除能力Fig.5 The scavenging activities of different polarity fractions of extracts from mango leaves towards DPPH feel radical

從圖5可知，芒果葉四種不同極性部位的提取物對DPPH自由基均具有一定清除能力，且隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增加，清除率也隨之增強，當清除率達到90%以上后，各提取物的清除率增長減緩，表明樣品與DPPH反應達到飽和。其中乙酸乙酯、正丁醇萃取物與芒果苷、VitC標品的清除率相當。

由于各樣品溶液及標準品溶液濃度與清除率間并不呈線性關系，所以使用SPSS17.0的PROBIT方法進行回歸分析。得到方程：PROBIT（P）=Intercept+BX，模型擬合優(yōu)度經(jīng)過卡方檢驗，再從PROBIT分析的結(jié)果中查得IC50值（即Prob=0.50時的樣品濃度），及其95%置信區(qū)間，結(jié)果見表1。

表1 芒果葉不同極性部位提取物及對照品的IC50值Table 1 The IC50values of different polarity fractions of extracts from mango leaves and reference substance

結(jié)果表明，芒果葉的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水部位提取物的IC50值分別為：102.877、9.014、19.494、221.784 μg/mL。IC50值越小，表明清除 DPPH 自由基的能力越強，從試驗結(jié)果可以看出：芒果葉不同極性部位提取物抗氧化活性的順序，乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位。乙酸乙酯提取物的IC50值與對照標品芒果苷及VitC的相當。

2.4 芒果葉不同極性部位提取物黃酮含量與抗氧化活性的相關性

使用SPSS17.0軟件對芒果葉各部位提取物的黃酮含量與其清除DPPH自由基的IC50值進行相關性分析，結(jié)果顯示黃酮含量與IC50值的相關系數(shù)為-0.872（P=0.000），表明黃酮含量越高其IC50值越小。以“提取劑的種類”為協(xié)變量的情況下，黃酮含量與IC50值的偏相關系數(shù)為-0.945（P=0.000），說明考慮不同極性的提取劑對抗氧化活性的影響后，兩者間的相關系數(shù)變大。同時，“提取劑的種類”與IC50值的Spearman相關系數(shù)為0.482，“提取劑的種類”對IC50值的影響較小，所以可以認為黃酮含量是影響IC50值的主要因素，即芒果葉不同極性提取物的抗氧化活性的變化，主要受到其黃酮類物質(zhì)含量高低的影響。

3 結(jié)論

本研究以攀枝花凱特芒果葉為原料，用95%乙醇冷浸提取后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別得到三個組分，最后的剩余部分為水部位。用DPPH法綜合評價芒果葉不同部位提取物的抗氧化活性，以IC50值作為評價清除DPPH自由基能力的指標，用芒果苷和抗壞血酸作為對照品進行自由基清除率的比較。試驗結(jié)果表明芒果葉不同極性部位提取物均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取物抗氧化活性最強，其次依次為正丁醇、石油醚、水部位提取物。分析結(jié)果表明，芒果葉各極性部位提取物的黃酮含量與清除DPPH自由基的能力呈負相關，芒果葉各部位提取物的黃酮含量是影響其抗氧化活性的主要因素。

本試驗初次對芒果葉的抗氧化活性進行測定分析，且首次對抗氧化的反應條件進行考察與優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯萃取物具有很高的抗氧化活性，與芒果苷及抗壞血酸標品相當。由于芒果樹每年會有枝葉修剪以及大量落葉，收集方便且目前沒有對其進行利用，所以充分利用芒果葉，將芒果葉提取物用于抗氧化活性用途的開發(fā)，可以避免資源的浪費、提高芒果的綜合開發(fā)價值。但其各部位提取物的化學成分及其具體抗氧化機制尚未明確，有待進一步深入研究。

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