王艷菊，馬建偉，王曦茁，周 方，張柏林，*，汪來發(fā)，*

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，國家林業(yè)局森林保護學重點實驗室，北京 100091）

原花青素（procyanidins，PC）是聚多酚類化合物，廣泛存在于多種植物體中，被認為具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、抗突變、保護心血管系統(tǒng)等多重功效[1-2]。目前對葡萄籽原花青素的研究多集中在抗氧化作用和對心血管疾病預防等方面，而對抗衰老的影響，報道相對較少。衰老是老齡化社會持續(xù)關注的社會和經濟問題之一，據2012年2月22日國家統(tǒng)計局發(fā)布的數據顯示，我國65歲及以上老年人口比重已達到9.1%，老年人口達到12288萬人，我國已經進入老齡化社會。預計到2040年，我國60歲以上老年人口將達到約4億人，占總人口26%。衰老以及與衰老相關的疾病已成為日趨嚴重的社會問題，因此闡明衰老的機制以及干預衰老進程具有重要的現實意義。如果能夠通過食物達到延緩衰老的目的，對延緩生物衰老具有重要意義。江巖[3]以黑腹果蠅為模式生物，研究了新疆藥桑葚花青素對黑腹果蠅衰老的影響。研究表明喂食112.5mg/kg新疆藥桑葚花青素可以顯著延長黑腹果蠅的半數致死時間、平均壽命及平均最高壽命，且存在劑量-反應關系。Liu等[4]發(fā)現藍莓花青素可以延緩視網膜色素上皮細胞的衰老。Chio等[5]用WI-38人類二倍體纖維母細胞經300μmoL/L H2O2處理后做早衰細胞模型，與對照組相比，添加花青素組細胞的生存能力顯著增加，并顯著延長了不同時期細胞的壽命。Yokozawa等[6]用老鼠作為模型，喂食柿子原花青素后顯著增加了早衰老鼠SAMP8的壽命，并且沒有引起諸如跳躍、倒掛在籠子上等行為學上的改變。

國內外研究中，用于衰老研究的生物模型主要以果蠅和小鼠為主，近年來秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為一種熱點模式生物，因其生命周期短、個體小、易于培養(yǎng)[7]，且在衰老進程方面，線蟲與脊椎動物有保守一致的特點等[8]，成為衰老研究中的首選模型[9]。本文選取來自葡萄籽中的原花青素作為材料，以衰老研究的熱點生物秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究了不同濃度下原花青素對線蟲壽命、運動能力、生殖能力、氧化應激和熱應激等方面的影響，旨在評價葡萄籽原花青素延緩秀麗隱桿線蟲衰老的效果，初步探討其作用機制，為葡萄籽原花青素的深度利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型秀麗隱桿線蟲（C.elegans）N2中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院惠贈；葡萄籽原花青素 陜西浩洋生物技術有限公司，純度≥95%；百草枯 SIGMA-ALDRICH公司，純度≥98%；瓊脂粉 日本Japan公司；胰蛋白胨 英國OXOID公司；CaCl2分析純，國藥集團化學試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O 分析純，西隴化工股份有限公司；膽固醇、無水乙醇、NaCl 分析純，北京化工廠。

HPG-400HX人工氣候箱 中國深圳市永業(yè)昌機電有限公司；SMZ645體視顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲培養(yǎng) 采用Brenner[10]的方法，將雌雄同體線蟲飼養(yǎng)與涂布大腸桿菌OP50（E.coliOP50）的線蟲標準培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）上，培養(yǎng)溫度20℃，觀察線蟲生長情況，定期將線蟲轉至新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中。

NGM固體培養(yǎng)基配方（1L）：氯化鈉3g，瓊脂粉17g，胰蛋白胨2.5g，加入975mL蒸餾水，120℃滅菌15min，55℃水浴15min后無菌條件下加入1mol/L CaCl2、1mol/L MgSO4及5mg/mL溶解于無水乙醇中的膽固醇各1mL和25mL 1mmoL/L pH6.0磷酸鉀緩沖液，混勻后倒入培養(yǎng)皿。

線蟲的同期化方法：參照Lakowski等[11]的方法，將處于產卵期的雌雄同體線蟲置于含或者不含原花青素的NGM板中產卵1～2h，移走成蟲，將平板置于20℃培養(yǎng)，卵孵化后，線蟲的發(fā)育即處于同一時期。

1.2.2 線蟲壽命測定 將葡萄籽原花青素用蒸餾水溶解，配制成19mg/mL的貯存液，用細菌過濾器過濾除菌，備用。實驗設定對照組（原花青素終濃度為0μg/mL）、低劑量組（原花青素終濃度為100μg/mL）、中劑量組（原花青素終濃度為200μg/mL）和高劑量組（原花青素終濃度為300μg/mL）。將原花青素貯存液按照比例加入NGM培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為100、200、300μg/mL，觀察線蟲對添加在NGM培養(yǎng)基中原花青素物質的生長發(fā)育反應。

按照同期化方法處理線蟲，記錄產卵當天為壽命實驗第0d，注意在產卵期每天將線蟲挑至新的涂有E.coliOP50的NGM板上。每天在顯微鏡下觀察線蟲，并記錄線蟲生存、死亡以及剔除出實驗的數目。死亡判斷標準：對機械刺激無任何反應即視為死亡。剔除標準：由于爬至平皿壁或蓋上而干死；蟲卵在體內孵化而成袋樣蟲導致死亡；鉆進培養(yǎng)基中。

1.2.3 運動能力測定 分為對照組和200μg/mL原花青素組。按照同期化方法處理線蟲，從第4d起，每天隨機抽取50～60條線蟲，記錄線蟲1min內走過的峰數。

1.2.4 生殖能力測定 分為對照組和200μg/mL原花青素組。將同期化處理后的L4期線蟲挑取至NGM板中，每板挑取一只線蟲，每組30個平板，此時記錄生殖實驗第1d。20℃培養(yǎng)，每隔8～12h將線蟲挑至新的NGM板上，直至生殖能力喪失。計數產卵量，并將所有產卵板置于20℃孵育2d后計數子代數目，并統(tǒng)計孵化率。

1.2.5 應激實驗

1.2.5.1 急性熱應激實驗 實驗設定對照組（0μg/mL GSP）和原花青素組（200μg/mL GSP）。首先，將線蟲進行同期化處理后置于20℃培養(yǎng)，為防止孵化的卵影響結果，產卵期每天將線蟲挑至新培養(yǎng)基。參照Saul等[12]方法，在成年期的第6d，將線蟲轉至35℃進行培養(yǎng)，每小時計數線蟲死亡、存活的數目，計算線蟲在35℃時的熱應激存活率。每組30條，重復3次。線蟲死亡標準同壽命實驗。

1.2.5.2 氧化應激實驗 將百草枯用蒸餾水溶解，分別添加到NGM培養(yǎng)基和含有200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基中，使其終濃度為10mmol/L。然后將NGM培養(yǎng)基分組為：正常NGM培養(yǎng)基（0μg/mL GSP），含有200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（200μg/mL GSP），含有10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat），含10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）。將線蟲進行同期化處理后置于20℃培養(yǎng)，在成年期的第6d，將在正常NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的秀麗隱桿線蟲分別挑至正常NGM培養(yǎng)基（0μg/mL GSP）和含10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat）中；將在飼喂200μg/mL原花青素的秀麗隱桿線蟲分別挑至含200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（200μg/mL GSP）以及含10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）中，每隔24h記錄線蟲存活情況，統(tǒng)計線蟲在氧化應激條件下的存活率（%）。每組30條，重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用SPSS Statistics 20.0進行統(tǒng)計分析，以平均值±標準差表示，組間比較采用ANOVA分析。

2 結果與討論

2.1 不同濃度原花青素對線蟲壽命的影響

不同濃度的葡萄籽原花青素對線蟲壽命的影響如圖1所示。從線蟲的全程生存情況看，與對照組（0μg/mL）相比，無論是采用中劑量組（200μg/mL）及高劑量組（300μg/mL）的原花青素飼喂線蟲，均能使線蟲生存曲線右移，但是采用低劑量組原花青素（100μg/mL）效果則不明顯。

圖1 線蟲生存曲線Fig.1 Survival curves of C.elegans

如表1所示，就對照組而言，線蟲的平均壽命為（20.6±3.0）d，最大壽命為（26.3±1.2）d。對中劑量組而言，線蟲的平均壽命為（25.9±4.2）d，延長了25.7%（p＜0.001）；最大壽命為（32.6±1.9）d，延長了24.0%（p＜0.01），與對照組相比，差異極顯著。對高劑量組而言，線蟲的壽命較對照組顯著延長，其中平均壽命為（24.7±4.9）d，最大壽命達到（32.5±1.3）d，但對線蟲壽命的延長效果不如中劑量組，所以選取200μg/mL作為最優(yōu)劑量組，繼續(xù)進行研究。

表1 不同濃度原花青素對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 1 Effects of procyanidins on the lifespan of C.elegans

Tadahiro等[13]研究了蘋果原花青素對線蟲衰老的影響，結果表明采用65、100μg/mL的蘋果原花青素飼喂線蟲，線蟲的壽命延長效果分別為12.1%和12.0%，延長壽命效果相似。Wilson等[14]在藍莓多酚研究中發(fā)現，與飼喂200μg/mL原花青素相比，取食67μg/mL原花青素能使秀麗隱桿線蟲平均壽命的提高28%，壽命最大值提高14%。顯然，不同植物中所含原花青素因種類與結構不同，原花青素延緩衰老的適宜劑量或許也存在差異。

2.2 原花青素對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響

與對照組相比，飼喂原花青素的秀麗隱桿線蟲運動速度增加，顯著差異從第6d開始，平均每天每分鐘爬過的峰數顯著延長13.2%（p＜0.05），表明飼喂原花青素增加了線蟲的運動能力，緩解了線蟲運動能力隨年齡的增加而下降的情況（圖2）。

圖2 原花青素對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響Fig.2 Effects of procyanidins on the movement of C.elegans

2.3 原花青素對秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響

飼喂原花青素后線蟲的生殖峰期較對照組略有延遲（圖3）。在對照組中，線蟲的生育高峰期發(fā)生在第1d至第3d，且第2d最多。對于原花青素組，則線蟲的生育高峰期發(fā)生在第2d至第4d，且第3d最多。與對照組相比，盡管在原花青素組線蟲總產卵量低，但是與對照組相比并無統(tǒng)計學差異。將所有產卵板置于20℃孵育2d后計數子代數目，并統(tǒng)計孵化率（圖4）。在對照組，線蟲的孵化率為95.6%±1.2%，在原花青素組則為94.4%±1.4%，無統(tǒng)計學差異。

圖3 原花青素對秀麗隱桿線蟲產卵量的影響Fig.3 Effects of procyanidins on the reproduction of C.elegans

一般認為，壽命的延長或許與生殖能力存在固有的逆向關系[15]。但實驗結果表明飼喂原花青素并沒有影響秀麗隱桿線蟲的生殖能力及卵的孵化率，也就是說取食原花青素后，線蟲壽命的延長并不是以降低或喪失其生殖能力為代價的。自然界中，某些延長壽命的天然物也存在類似的現象[16]，如兒茶素、槲皮素、藍莓提取物等延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，但并沒有影響產卵量[17-19]。

圖4 原花青素對秀麗隱桿線蟲孵化率的影響Fig.4 Effects of procyanidins on the hatchability of C.elegans

2.4 原花青素對秀麗隱桿線蟲壓力應激能力的影響

熱應激脅迫條件下，在成年的第6d，將線蟲轉至35℃培養(yǎng)，飼喂原花青素組線蟲的生存曲線明顯右移。對照組（0μg/mL）的平均生存時間為（15.4±4.8）h，原花青素組的平均生存時間為（19.6±4.4）h，比對照組顯著延長了27.3%（p＜0.01）。表明飼喂原花青素能顯著增強線蟲的耐熱能力（圖5）。

圖5 熱應激條件下線蟲的生存曲線Fig.5 Survival curves of C.elegans in thermotolerance assays

線蟲的生存曲線見圖6。在百草枯誘導的氧化脅迫條件下，在含有10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat）中培養(yǎng)的秀麗隱桿線蟲的平均存活時間為（64.9±2.6）h，在含有10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）中培養(yǎng)的線蟲的平均存活時間為（72.2±2.8）h，平均生存時間較含10mmol/L百草枯組延長了11.2%（p＜0.05），由此可見，在氧化應激脅迫條件下葡萄籽原花青素能夠很好的保護秀麗隱桿線蟲，緩解極端氧化條件對線蟲的損傷。

壽命的延長與壓力應激狀態(tài)下生存率的提高有很強的正相關性，線蟲在脅迫條件下存活率越高，則延長秀麗隱桿線蟲壽命越好[20]。Wilson等[14]發(fā)現在35℃熱應激16h的條件下，飼喂藍莓多酚，線蟲的存活率較對照組增加了2.5倍，但對于百草枯與H2O2所造成的氧化應激脅迫，飼喂藍莓多酚并沒有增加線蟲的存活率。Pietsch等[21]發(fā)現，槲皮素不僅可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命，而且增加了線蟲在熱脅迫和氧化脅迫下的生存率。

圖6 氧化應激條件下線蟲的生存曲線Fig.6 Survival curves of C.elegans in oxidative stress assays

3 結論

飼喂葡萄籽原花青素可以顯著增加線蟲的壽命，增強線蟲的運動能力，延緩線蟲的衰老過程，且200μg/mL原花青素或許有更好的延緩線蟲衰老的效果，這種防止線蟲壽命衰老的效果可能是通過改善壓力應激條件下的生存率來達到的。

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