葉生梅，丁葉強(qiáng)，張國(guó)慶

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2.安徽省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程研究所，安徽合肥 230041）

當(dāng)今利用微生物（黑曲霉）發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的主要原料是含淀粉量高的糧食（如薯類(lèi)、谷類(lèi)、糖蜜等）。我國(guó)科研工作者通過(guò)精心選育得到了利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)檸檬酸的高產(chǎn)菌種。世界人口的增長(zhǎng)和糧食的匱乏制約乙醇、檸檬酸等以糧食為原料的工業(yè)的發(fā)展。我國(guó)有豐富的秸稈資源，近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)村生活能源結(jié)構(gòu)的變化，秸稈逐漸由傳統(tǒng)的做飯、取暖的原料變成了無(wú)用的負(fù)擔(dān)物。秸稈的就地焚燒產(chǎn)生的煙霧已成為影響空氣質(zhì)量和公共安全的公害。如何以秸稈等纖維素為原料，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)燃料（如乙醇、沼氣等）及有機(jī)化工產(chǎn)品（如檸檬酸等）成為秸稈綜合利用的重要課題?？稍偕缘慕斩捹Y源的高值化利用，對(duì)解決我國(guó)的秸稈焚燒、“三農(nóng)”問(wèn)題、能源問(wèn)題和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

纖維素燃料乙醇的生物轉(zhuǎn)化是近來(lái)的研究熱點(diǎn)，而纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸）的研究較少[1-4]。本文通過(guò)對(duì)一株黑曲霉S的纖維素酶發(fā)酵特性和產(chǎn)酸馴化篩選研究，以期獲得具有利用纖維素原料產(chǎn)酸的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬酸、蔗糖、草酸、NH4NO3、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO47H2O、HCl、CaCl2、NaOH等 均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純；CMC-Na（CP）、山芋淀粉、麩皮 市售；稻草、玉米秸稈、稻殼 采自蕪湖市東郊農(nóng)村；黑曲霉S（Aspergillus niger S）從土壤中分離，本校微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；斜面培養(yǎng)基 PDA；初篩培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基中添加0.02%溴甲酚綠指示劑；馴化篩選培養(yǎng)基 高檸檬酸-高滲察氏平板；酸性薯干粉水解平板[6]；種子培養(yǎng)基（%） 葡萄糖3，麩皮2，（NH4）2SO40.2，KH2PO40.2，MgSO47H2O 0.05；以預(yù)處理稻草等纖維素為基質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基（%） 預(yù)處理纖維素原料3，麩皮2，葡萄糖2，（NH4）2SO40.2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基500mL蒸餾水于水浴鍋中加熱至50℃，加入60g山芋淀粉，攪拌均勻后加淀粉酶（6U/g原料）50℃保溫10min，1℃/min升溫至95℃，保溫20min，然后迅速升至沸騰并維持20min，約5min內(nèi)降溫至60℃，加營(yíng)養(yǎng)鹽（KH2PO41g，NH4NO31g，MgSO4·7H2O 0.12g，MnSO40.01g）加水保持原體積。

HH-6型電熱恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；QHZ-123B型全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；722型分光光度計(jì)、PHSJ-5型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DSX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 稻草秸稈、玉米秸稈、稻殼的預(yù)處理采用文獻(xiàn)[4]中的方法 秸稈切成1～2cm的小段與3%氫氧化鈉溶液（固液比w/v為1∶5）混勻，置于高壓蒸汽滅菌鍋中0.15MPa保溫5min，立即放氣。預(yù)處理后用水洗至pH7.5，50℃烘干后粉碎備用。

1.2.2 黑曲霉孢子懸液的制備 用無(wú)菌生理鹽水將活化的斜面菌種孢子刮下，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶并振蕩，再用滅菌脫脂棉過(guò)濾到另一滅菌三角瓶得單孢子懸液，調(diào)整孢子數(shù)105～106個(gè)/mL。

1.2.3 黑曲霉S的產(chǎn)酸馴化篩選[6]黑曲霉S的孢子懸液稀釋后涂布于高檸檬酸-高滲察氏平皿35℃培養(yǎng)5d，選擇生長(zhǎng)快和孢子頭大的轉(zhuǎn)接于酸性薯干粉水解液平板35℃培養(yǎng)7d，挑選酸性薯干粉水解液平板上不長(zhǎng)孢子的菌落轉(zhuǎn)接于含0.02%溴甲酚綠的PDA選擇性平皿，35℃培養(yǎng)5d，選取10個(gè)黃色變色圈與菌落直徑比較大的菌落，保持于PDA斜面。

1.2.4 種子培養(yǎng)及發(fā)酵 接種1mL/瓶黑曲霉孢子懸液于種子培養(yǎng)基，30℃，150r/min培養(yǎng)24h。以10%的接種量接種種子液于纖維素基質(zhì)發(fā)酵，發(fā)酵條件30℃，200r/min培養(yǎng)24h后以35℃，250r/min培養(yǎng)。每個(gè)發(fā)酵三重復(fù)。

以糖化山芋淀粉為基質(zhì)的檸檬酸發(fā)酵：直接用黑曲霉孢子懸液接種，1mL/瓶，35℃，200r/min，培養(yǎng)4d。每個(gè)發(fā)酵三重復(fù)。

1.2.5 分析測(cè)試方法 酸度的測(cè)定—NaOH滴定法[7]：發(fā)酵液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，0.5%酚酞做指示劑，每毫升發(fā)酵液消耗NaOH的毫升數(shù)即為發(fā)酵液中檸檬酸的百分比含量（g/100mL）。

還原糖的測(cè)定：DNS法[8]。

pH的測(cè)定：酸度計(jì)或精密pH試紙。

孢子計(jì)數(shù)：血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法[5]。

纖維素酶活力測(cè)定[8]：CMC酶活力測(cè)定：25mL具塞試管中加入1.5mL以0.2mol/L pH5.0 HAc NaAc緩沖液配制的1%CMC-Na溶液，置于50℃水浴中預(yù)熱5min。加1.0mL適當(dāng)稀釋的酶液，搖勻，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)30min，之后加入DNS試劑1.5mL，放入沸水浴顯色5min，取出后立即置于冰水中冷卻至室溫，定容至25mL，搖勻。以相同條件下沸水浴滅活5min的酶液為空白，在波長(zhǎng)540nm條件下測(cè)定吸光度值。按DNS法測(cè)定還原糖含量。酶活單位的定義：上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化纖維素水解生成1μg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位，用U/mL表示。

濾紙酶活力測(cè)定：取檸檬酸緩沖液（pH5.0）1.5mL，加入新華定量濾紙1條（1cm×6cm、（50±1）mg），再加入粗酶液1.0mL，50℃恒溫水浴保持1h，加入DNS試劑1.5mL，于沸水浴中放置5min，冷卻，定容至25mL，以相同條件下沸水浴滅活5min的酶液為空白，于540nm處測(cè)定其吸光度值，按DNS法測(cè)定還原糖含量。在上述條件下，每分鐘催化水解底物生成1μg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活單位，用U/mL表示。

發(fā)酵后固形物質(zhì)量的測(cè)定：濾渣用100mL蒸餾水洗滌后置80℃烘干至恒重，稱(chēng)重（g）。

固形物的變化量（g）=發(fā)酵后固形物的質(zhì)量（g）-發(fā)酵前預(yù)處理稻草的質(zhì)量（g）。

黑曲霉利用預(yù)處理稻草發(fā)酵產(chǎn)酸率（%）=M總酸（g）/原料（g）×100。

紙層析法鑒定酸成分以1%草酸、1%檸檬酸為標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)酵上清液為待測(cè)樣品，展開(kāi)劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=12∶3∶5（v/v/v），室溫上行展層9h，70～80℃烘干4h，冷卻后噴上溴酚藍(lán)顯色劑。計(jì)算Rf值。Rf=d1/d2式中，d1為各顯色點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)的距離（cm）；d2為點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離（cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S的形態(tài)觀察

菌落形態(tài)：在PDA平板上氣生菌絲短，呈絨毛狀，圓形，幼時(shí)略顯黃色，孢子成熟后菌絲白色，菌落背面無(wú)色，有褶皺，孢子黑色（見(jiàn)圖1左，放大倍數(shù)16×10）。菌株顯微形態(tài)：普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲有隔.（見(jiàn)圖1右，放大倍數(shù)16×40），孢子梗頂部膨大呈球形，球形表面著生小梗呈輻射狀排列，分生孢子串生于小梗頂部，分生孢子黑色（見(jiàn)圖1中，放大倍數(shù)16×40）。

圖1 菌株S的菌落特征及顯微形態(tài)Fig.1 Characteristics of colony and microscopic form on the strain S

2.2 菌株纖維素原料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌株利用CMC-Na發(fā)酵特性 以10%的接種量接種種子液于CMC-Na基質(zhì)發(fā)酵，分別在不同時(shí)間取樣測(cè)定CMC酶活力、pH，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株S利用CMC-Na發(fā)酵特性Table 1 Characteristics of fermentation with CMC-Na on the strain S

由表1可看出，發(fā)酵12h時(shí)CMC酶活力達(dá)到201.1U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株產(chǎn)酸使發(fā)酵液pH下降很快，纖維素酶活力也下降很快。發(fā)酵46h纖維素酶未檢出，酸度達(dá)到0.9%。從發(fā)酵結(jié)果看該菌株具有纖維素酶系基因，有利用CMC-Na為原料產(chǎn)酸的能力。

2.2.2 以不同纖維素原料為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)酸特性 鑒于該菌株具有較高的CMCase酶活力且產(chǎn)酸，以CMC-Na為對(duì)照，進(jìn)一步考察以預(yù)處理的稻草、玉米秸稈、稻殼為碳源該菌株的纖維素酶活力、產(chǎn)酸性能。分別在12、24h取樣測(cè)定CMCase酶、濾紙酶（FPase酶）活力。發(fā)酵48h后，各發(fā)酵瓶中菌絲結(jié)成小球，發(fā)酵液透明易過(guò)濾，測(cè)定濾液的酸度、pH，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 以纖維素原料為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)酸比較Table 2 The compare of producing cellulase and acid with cellulose raw material on the strain S

由表2可見(jiàn)，菌株以三種秸稈類(lèi)纖維素原料發(fā)酵具有以CMC-Na同樣的特點(diǎn)，即在發(fā)酵12h酶活力高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行CMCase酶、濾紙酶（FPase酶）酶活力下降，到24h時(shí)CMCase酶活降到約為12h時(shí)的四分之一，24h時(shí)以稻草為基質(zhì)的濾紙酶（FPase酶）活力降為12h時(shí)的二分之一，另外幾種原料的下降更快。從三種預(yù)處理原料看，以預(yù)處理稻草為碳源，發(fā)酵12h、24h的CMC酶活力、濾紙酶活力均最高；發(fā)酵48h時(shí)測(cè)定酸度，以稻草為基質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)酸也最高，而玉米秸稈和稻殼為原料的發(fā)酵纖維素酶活及產(chǎn)酸都不及稻草，可能與原料的組成有關(guān)，預(yù)處理稻草為其產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)酸的適宜碳源。

2.3 黑曲霉S產(chǎn)酸的馴化篩選

通過(guò)馴化篩選，選取10個(gè)黃色變色圈與菌落直徑比較大的菌落，保存于PDA斜面，并用檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩，培養(yǎng)4d測(cè)定酸度，篩選結(jié)果如表3所示，菌株S6產(chǎn)酸水平略高，其余菌株產(chǎn)酸水平相當(dāng)，選取菌株S6作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用菌種。

2.4 黑曲霉S6產(chǎn)酸發(fā)酵產(chǎn)物鑒定及菌株產(chǎn)酸穩(wěn)定性檢驗(yàn)

用黑曲霉S6孢子懸液接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基培養(yǎng)4d。過(guò)濾，取濾液測(cè)定酸度、紙上層析法鑒定產(chǎn)酸成分，根據(jù)進(jìn)行比較。從層析結(jié)果看，發(fā)酵液樣品的黃色斑點(diǎn)與檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品的Rf基本一致，檸檬酸標(biāo)樣（Rf=0.52）與發(fā)酵上清液樣品（Rf=0.49）且發(fā)酵液的草酸斑點(diǎn)幾乎看不出，表明該菌株產(chǎn)酸發(fā)酵產(chǎn)物較純，主要為檸檬酸。將菌株連續(xù)傳代發(fā)酵5批，發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果如表4所示，從表4可見(jiàn)，菌株S6產(chǎn)酸性能穩(wěn)定。

表3 菌株S產(chǎn)酸復(fù)篩結(jié)果Table 3 The rescreening results of acid-producing of the strain S

表4 菌株S6產(chǎn)酸穩(wěn)定性檢驗(yàn)Table 4 The stability of acid-producing on the strain S6

2.5 黑曲霉S6以預(yù)處理稻草為基質(zhì)產(chǎn)檸檬酸實(shí)驗(yàn)

以10%的接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基，每隔12h取樣，發(fā)酵液過(guò)濾，濾液測(cè)定pH、酸度、還原糖；濾渣用100mL蒸餾水洗滌后置80℃烘干，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中固形物（草料+生物量）的變化、纖維素和半纖維素含量的變化。

發(fā)酵液的性狀：培養(yǎng)24h時(shí)，觀察到發(fā)酵液中的菌球較少，到36h時(shí)發(fā)酵液中的菌絲球細(xì)小而密，發(fā)酵液顏色變淺，氣味香甜。發(fā)酵48、60h時(shí)發(fā)酵瓶中的性狀如36h時(shí)。但到72h后菌絲球似有溶解，發(fā)酵液過(guò)濾速度變慢。

圖2 發(fā)酵過(guò)程還原糖、pH的變化Fig.2 The fermentation process of changes profile of reduced suger utilization and pH

圖3 發(fā)酵過(guò)程中酸度和產(chǎn)酸率的變化Fig.3 The fermentation process of changes of the concentration of citric acid and acid production rate

從圖2發(fā)酵過(guò)程中pH、還原糖的變化看出，發(fā)酵12～48h發(fā)酵液中還原糖下降迅速，說(shuō)明菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中草料及其他基質(zhì)被利用。菌種生物量增長(zhǎng)且產(chǎn)酸，發(fā)酵液的pH下降。60h后，發(fā)酵過(guò)程基本結(jié)束。pH也趨于穩(wěn)定在2.5左右。從圖3可見(jiàn)，發(fā)酵過(guò)程中酸度、產(chǎn)酸率在12～60h之間增加較快，到60h后產(chǎn)酸不再增加，也說(shuō)明到60h時(shí)發(fā)酵趨于結(jié)束。產(chǎn)酸達(dá)0.82%。稻草纖維素的產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率達(dá)22%。

通過(guò)測(cè)定發(fā)酵原料和殘?jiān)欣w維素和半纖維素的含量發(fā)現(xiàn)，由于發(fā)酵過(guò)程中菌體生物量的增加，發(fā)酵過(guò)程纖維素、半纖維素的變化不能反映發(fā)酵液中草料的變化（數(shù)據(jù)未列出）。但通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中固形物與原料中草料的質(zhì)量差（即固形物的變化）如圖4可知，發(fā)酵開(kāi)始階段草料的利用大于菌體的生長(zhǎng)，固形物的變化為負(fù)；隨著菌體的生長(zhǎng)，生物量的增加大于草料的利用，固形物的變化為正；到48h后，菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期；從72～84h菌體已到衰亡期，固形物的變化有所降低。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中固形物的變化Fig.4 The fermentation process of changes of change in solids

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵過(guò)程纖維素草料利用快。直接利用菌株S6的纖維素酶系和產(chǎn)酸酶系分解纖維素原料產(chǎn)酸，纖維素酶解和產(chǎn)酸進(jìn)行偶聯(lián)，省去了纖維素原料糖化過(guò)程[9-10]，節(jié)約了秸稈類(lèi)纖維素利用的成本。因此，菌株S6有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)用淀粉質(zhì)以外的原料產(chǎn)檸檬酸的研究中，有報(bào)道用甘蔗渣[11]、蘋(píng)果渣[12]、纖維素水解液[9-10]等產(chǎn)檸檬酸的研究。由于目前的纖維素酶活力不高，使纖維素酶解糖化的成本高，限制了纖維素原料的高值化工業(yè)應(yīng)用。本文利用馴化篩選的黑曲霉S6對(duì)直接利用纖維素原料產(chǎn)檸檬酸進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，菌株S6能利用纖維素原料產(chǎn)酸，且預(yù)處理稻草為產(chǎn)酸的適宜碳源。以預(yù)處理稻草為碳源，發(fā)酵12h CMC酶活力達(dá)218.4U/mL，濾紙酶活力44.1U/mL，發(fā)酵60h產(chǎn)酸率達(dá)22%。酶解和產(chǎn)酸偶聯(lián)進(jìn)行，省去了將纖維素酶解的步驟，節(jié)約了成本。此外，發(fā)酵提取檸檬酸后的殘?jiān)ňw+未利用的秸稈成分）可作為動(dòng)物飼料，因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程增加了殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)含量，降低了原料中難以消化吸收的物質(zhì)等。

研究中發(fā)現(xiàn)，菌株S的纖維素酶不耐酸，纖維素酶失活快。如何提高菌株S的纖維素酶酶活力、產(chǎn)酸率；特別是如何提高纖維素酶耐酸能力保持其在低pH下的活力是具有挑戰(zhàn)性的課題，有待進(jìn)一步研究探索。

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