CYP2C9-1061A/C基因多態(tài)性對(duì)特發(fā)性房顫患者華法林用量的影響

李 銳，邱 健 ，馬 駿，黎建安，何建新，阮云軍，肖 華，張 園，葉麗麗

目的 探討CYP2C9-1601A/C基因多態(tài)性在廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者中的分布及其對(duì)華法林用量的影響。方法 選擇廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者150例為病例組，正常人群120 例作為對(duì)照組，采用PCR-RFLP方法檢測(cè)CYP2C9基因，比較兩組CYP2C9-1601A/C基因型分布特征，并對(duì)不同基因型的特發(fā)性房顫患者華法林用量進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 CYP2C9基因1601位A堿基突變?yōu)镃后，能夠被Kpn Ⅰ內(nèi)切酶識(shí)別，產(chǎn)生134 bp和18 bp兩個(gè)片段。特發(fā)性房顫患者中，CYP2C9-1061 AA型105例(70.0%)，AC型40例(26.7%)，CC型5例(3.3%)。AC型比例顯著高于正常人群(χ2=13.3259，P=0.0003)，AA型比例顯著低于正常人群(χ2=14.5200，P=0.0000)，CC型發(fā)生率兩組無(wú)顯著差異(χ2=0.2218，P=0.6377)。AC型及CC型患者華法林用量(3.62±0.58)mg、(3.12±0.16)mg均顯著低于AA型的(4.28±0.63)mg(P<0.01)；CC型患者低于AC型(P<0.05)。結(jié)論 廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者中存在較多的CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性，并且CYP2C9 1061A/C突變使患者的華法林用量減低，可作為臨床個(gè)體化用藥的參考。

特發(fā)性房顫；CYP2C9；基因多態(tài)性；華法林

房顫是臨床常見(jiàn)的心律失常，其中無(wú)明確病因及器質(zhì)性心臟病的房顫稱為特發(fā)性房顫。栓塞性腦卒中及其他血栓栓塞事件是房顫最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，特別是腦卒中的發(fā)生率逐年增加，有較高的致死致殘率[1]。華法林可以顯著減少房顫血栓栓塞性事件，是目前預(yù)防房顫血栓栓塞事件的有效藥物[2]。隨著華法林藥理作用分子機(jī)制的闡明和藥物基因組學(xué)的進(jìn)展，人們?cè)絹?lái)越重視部分相關(guān)基因的多態(tài)性作為遺傳因素在華法林治療劑量個(gè)體差異中的作用。細(xì)胞色素酶P450 2C9(cytochrome P450 family 2 subfamily C polypeptide 9,CYP2C9)基因是影響華法林治療劑量個(gè)體差異的相關(guān)基因之一，它的基因多態(tài)性是影響華法林治療劑量個(gè)體差異最主要的遺傳因素[3-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)150例廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性，并與正常人對(duì)照，觀察CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性在特發(fā)性房顫患者中的分布特征。并分別比較CYP2C9不同基因型組華法林日平均維持劑量，了解CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性對(duì)廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者華法林日平均維持劑量的影響，為臨床華法林抗凝治療個(gè)體化給藥提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選擇廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院心血管內(nèi)科確診為特發(fā)性房顫的廣東地區(qū)150例患者為病例組，其中男性96例，女性54例，年齡38～82歲，平均65.3歲。特發(fā)性房顫診斷標(biāo)準(zhǔn)采用《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》第13版制定的標(biāo)準(zhǔn)，所選患者均在本院全程治療，有詳細(xì)的臨床檢驗(yàn)和治療資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：能嚴(yán)格按照醫(yī)囑服藥；使用同一廠家生產(chǎn)的華法林抗凝治療后國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)穩(wěn)定在2.0～3.0；年齡>18歲；漢族；確診特發(fā)性房顫。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往和現(xiàn)在有肝臟疾患、肝功能異常、腎功能不全、甲狀腺功能異常；正在服用影響華法林代謝的藥物；正在服用影響INR值的藥物，基礎(chǔ)INR值>1.4；不適合華法林治療者。同時(shí)收集同期在我院門診體檢且性別、年齡等均與病例組匹配的正常人120 例作為對(duì)照組，常規(guī)化驗(yàn)無(wú)異常，無(wú)各類心血管、腦血管、腎臟、內(nèi)分泌等方面疾病，其中男性82例，女性38例，年齡38～82歲，平均64.8歲。所有研究對(duì)象均測(cè)量身高、體重，并計(jì)算體表面積[BSA(m2)=0.0061×身高(cm)+0.0128×體重(kg)-0.01529]。

1.2 血標(biāo)本采集 研究對(duì)象簽署知情同意書后，抽取5 ml靜脈血置于EDTA-Na2抗凝管中保存于-70 ℃低溫冰箱中以備提取DNA。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 華法林劑量和INR 檢測(cè)靜脈血標(biāo)本INR。記錄病例組患者所服用的華法林維持劑量，即患者達(dá)到抗凝穩(wěn)態(tài)(INR=2.0～3.0)時(shí)華法林日用量。

1.3.2 CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)分析(PCR-RFLP)的方法檢測(cè)基因多態(tài)性。采用上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司提供的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，設(shè)計(jì)CYP2C9所需PCR的目的基因片段的引物(上游引物：5'-TGCACGTCCAGACCTAC-3'；下游引物：5'-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3') ，目的基因片段長(zhǎng)度由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)42個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。將 CYP2C9的PCR 產(chǎn)物用Kpn Ⅰ內(nèi)切酶(上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司)進(jìn)行酶切，37 ℃水浴 15～16 h。酶切產(chǎn)物采用具有高分辨能力的 3%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切片段進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C9基因1061A/C多態(tài)性 1061位A堿基突變?yōu)镃后，多肽鏈第359位氨基酸Ile被Leu取代，突變的堿基C能夠被Kpn Ⅰ內(nèi)切酶識(shí)別，產(chǎn)生134 bp和18 bp兩個(gè)片段，而野生型(AA型)不含Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)，電泳后僅顯示1個(gè)152 bp片段；純合變異型(CC型)產(chǎn)生134 bp和18 bp兩個(gè)片段；雜合變異性(AC型)產(chǎn)生152 bp、134 bp和18 bp 3個(gè)片段。但由于18 bp片段分子量太小，在凝膠電泳上不易分辨，因此只能顯示134 bp和152 bp片段(圖1)。

圖1 CYP2C9基因1061A/C多態(tài)性

2.2 CYP2C9基因1061A/C多態(tài)性在特發(fā)性房顫患者中的分布 150例特發(fā)性房顫患者中，CYP2C9-1061 AA型105例(70.0%)，AC型40例(26.7%)，CC型5例(3.3%)。 120例正常人群中，CYP2C9-1061 AA型107例(89.2%)，AC型11例(9.2%)，CC型2例(1.7%)。經(jīng)檢驗(yàn)兩組人群中基因型分布頻率觀測(cè)值及預(yù)計(jì)值差異不顯著，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，表明樣本均來(lái)自一個(gè)較大的并且處于隨機(jī)婚配的平衡狀態(tài)群體，具有代表性。特發(fā)性房顫患者中AC型比例顯著高于正常人群(χ2=13.3259，P=0.0003)；AA型比例顯著低于正常人群(χ2=14.5200，P=0.0000)，CC型發(fā)生率兩組無(wú)顯著差異(χ2=0.2218，P=0.6377)。

2.3 CYP2C9-1061A/C基因多態(tài)性對(duì)特發(fā)性房顫患者華法林用量的影響 不同基因型的特發(fā)性房顫患者年齡、男女比例及體表面積相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)比分析不同基因型患者達(dá)到抗凝穩(wěn)態(tài)(INR=2.0～3.0)時(shí)華法林日用量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同基因型患者華法林用量不同，AA型用量最高，其次是AC型，最低是CC型(P<0.05或P<0.01，表1)。表明CYP2C9基因1061位A突變?yōu)镃后，華法林用量減少。

表1 不同CYP2C9-1061基因型特發(fā)性房顫患者一般情況及華法林用量

注：與AA型相比，①P<0.01；與AC型相比，②P<0.05

3 討論

華法林在人肝臟中主要由CYP2C9介導(dǎo)其羥化代謝，并且呈立體選擇性，其中抗凝活性較強(qiáng)的S-華法林85%以上經(jīng)由CYP2C9代謝轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的6-和7-羥化產(chǎn)物。因此，CYP2C9酶是影響華法林代謝的主要酶，其活性影響華法林的抗凝效果，機(jī)體CYP2C9酶活性越低，則單位劑量華法林的抗凝效果越強(qiáng)，機(jī)體所需華法林劑量越低。CYP2C9酶是由CYP2C9基因編碼的。研究表明，CYP2C9在不同人群中的基因多態(tài)性與華法林的用量相關(guān)[5-7]。

Sanderson等[8]的系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示，攜帶*2和/或*3突變的患者其華法林劑量較野生型患者低37%，但該研究并未納入中國(guó)人群的相關(guān)研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因頻率在不同民族中有較大差異。在中國(guó)人群中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2突變，即沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CYP2C9 416C/T多態(tài)性，而存在較低的CYP2C9 1061A/C多態(tài)性，CYP2C9*3等位基因(C等位基因)頻率約為3.3 %[9]。本研究結(jié)果顯示，CYP2C9 1061A/C多態(tài)性在特發(fā)性房顫患者中發(fā)生率高于正常人群，并且主要集中在AC型。

CYP2C9基因具有高度遺傳多態(tài)性，較常見(jiàn)的基因突變體是位于外顯子3的CYP2C9*2(416C/T) 和位于外顯子7的CYP2C9*3(1061A/C)，二者已被證明與個(gè)體需要較低劑量的華法林有關(guān)，因其編碼的CYP2C9酶活性顯著降低[10]。攜帶這兩個(gè)等位基因的個(gè)體達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度所需要的華法林治療劑量較低，且在使用初期有較高出血危險(xiǎn)性。 關(guān)于CYP2C9 基因多態(tài)性與華法林劑量關(guān)系，目前國(guó)外研究一致認(rèn)為：它的兩種突變型 CYP2C9*2(外顯子3的416位堿基C突變?yōu)?T，導(dǎo)致多肽鏈第 144位氨基酸Arg被Cys取代)和 CYP2C9*3(外顯子7的第1061位堿基A突變?yōu)?C，導(dǎo)致多肽鏈第 359 位氨基酸Ile被Leu取代)都導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低，從而導(dǎo)致個(gè)體抗凝所需的華法林劑量降低。本研究發(fā)現(xiàn)，堿基A突變?yōu)镃后，華法林的用量顯著降低。

綜上所述，廣東地區(qū)特發(fā)性房顫患者中存在較多的CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性，并且不同CYP2C9 1061A/C基因型患者華法林用量不同，其中突變型顯著低于野生型?？梢?jiàn)CYP2C9 1061A/C基因多態(tài)性對(duì)特發(fā)性房顫患者華法林用量具有指導(dǎo)價(jià)值，可作為臨床個(gè)體化用藥的參考依據(jù)。

[1] 左惠娟，蘇江蓮，姚崇華.非瓣膜性房顫患者缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素暴露水平與聚集分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2008,29(8):819-822.

[2] 龔瑋琦，陳巍，劉玥.老年心房顫動(dòng)高?；颊呖鼓委煹乃幬镞x擇及安全性[J].中華老年心腦血管病雜志,2012,14(8):817-820.

[3] 武建才，趙克斌，胡敏.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林穩(wěn)定劑量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2013,11(4):465-467.

[4] 聞武，黃烽，陽(yáng)麗梅，等.CYP2C93,VKORC1-1639G〉A(chǔ)和CYP4F2 rs2108622基因多態(tài)性對(duì)華法林劑量的影響[J].中國(guó)胸心血管外科臨床雜志,2013(4):375-380.

[5] Natarajan S,Ponde CK,Rajani RM,et al.Effect of CYP2C9 and VKORC1 genetic variations on warfarin dose requirements in Indian patients[J].Pharmacol Rep,2013,65(5):1375-1382.

[6] Hadjipanagi D,Chrysanthou S,Voskarides K,et al.Genetic polymor-phisms in warfarin and tacrolimus-related genes VKORC1,CYP2C9 and CYP3A5 in the Greek-Cypriot population[J].BMC Res Notes,2014,7(1):123.

[7] Park SM,Lee JK,Chun SI,et al.VKORC1 and CYP2C9 genotype variations in relation to warfarin dosing in Korean stroke patients[J].J Stroke,2013,15(2):115-121.

[8] Sanderson S,Emery J,Higgins H.CYP2C9 gene variants,drug dose,and bleeding risk in warfarin-treated patients a HuGEnet systematic review and meta-analysis[J].Genetics in Medicine,2005,7(2):97-104.

[9] Hong X,Zhang S,Mao G,et al.CYP2C9*3 allelic variant is associated with metabolism of irbesartan in Chinese population[J].Eur J Clin Pharmacol,2005,61(9):627-634.

[10] Ye C,Jin H,Zhang R,et al.Variability of warfarin dose response associated with CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms in Chinese patients[J].J Int Med Res,2014,42(1):67-76.

Effects of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism on dosage of warfarin for patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation

Li Rui1,Qiu Jian1,Ma Jun1,Li Jianan2,He Jianxin1,Ruan Yunjun1,Xiao Hua1,Zhang Yuan1,Ye Lili1

1.Department of Cardiology,General Hospital of Guanzhou Military Command,Guangzhou,Guangdong,510010,China;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children's Hospital and Health Institute,Guangzhou,Guangdong,510010,China

Objective To explore the distribution of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation in Guangdong area and its effects on the dosage of warfarin.Methods 150 patients with idiopathic atrial paroxysmal fibrillation from Guangdong area were considered as patient group,and 120 healthy people from the same area were regarded as control group.The difference of the distribution of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism detected by PCR-RFLP between the 2 groups was compared and the difference of dosage of warfarin for the patients with different genotype was analyzed each other.Results The CYP2C9 gene fragment was cut into 134 bp and 18 bp by Kpn Ⅰ enzyme after the A base was mutated by C base.There were 105 patients (70.0%) with AA type,40 ones (26.7%) with AC type and 5 ones (3.3%) with CC type.Compared with the normal people,the ratio of AC type in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation was higher(χ2=13.3259，P=0.0003),AA ratio was lower(χ2=14.5200，P=0.0000),but CC ratio was not different obviously(χ2=0.2218，P=0.6377).The dosage of warfarin for patients with AC and CC type [(3.62±0.58)mg,(3.12±0.16)mg] was lower than that with AA type[(4.28±0.63)mg](P<0.01),and the dosage of warfarin for patients with CC type was lower than that with AC type(P<0.05).Conclusions There are more CYP2C9-1061A/C gene polymorphism in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation in Guangdong area.The mutation of CYP2C9-1061A/C decreases the dosage of warfarin.Therefore,CYP2C9 gene polymorphism can be used as reference to the personalized dosage regimen of warfarin in patients with idiopathic atrial paroxysmal fibrillation.

idiopathic paroxysmal atrial fibrillation；CYP2CP；gene polymorphism；warfarin

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(WSTJJ20111108廣文字第036092號(hào))

510010 廣州，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院心血管內(nèi)科(李 銳，邱 健 ，馬 駿，何建新，阮云軍，肖 華，張 園，葉麗麗)；廣東省婦幼保健院檢驗(yàn)科(黎建安)

邱 健，E-mail:lirui109xn@163.com

R 541.75

A

1004-0188(2014)05-0476-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.05.005

2014-03-30)