IRF-4結(jié)合蛋白對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的機(jī)制研究

潘 磊，簡(jiǎn)從相，李 卓，黃曉山

目的 觀察IRF-4結(jié)合蛋白(IBP)促進(jìn)口腔鱗癌(OSCC)細(xì)胞Tca8113生長(zhǎng)的機(jī)制。方法 利用實(shí)驗(yàn)室保存的口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113和先前建立的高表達(dá)IBP的口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113/IBP以及對(duì)照空質(zhì)粒細(xì)胞株Tca8113/C1，通過流式細(xì)胞術(shù)，觀察IBP過表達(dá)對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響，并通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)顯示IBP能縮短OSCC細(xì)胞的G1期，促進(jìn)其進(jìn)入S期，從而加快OSCC的增殖；并且Tca8113/IBP組細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)高于Tca8113及Tca8113/C1組；而cyclin E和 P27Kip1在各組細(xì)胞中的表達(dá)未見明顯變化。結(jié)論 IBP可能通過調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá)從而縮短OSCC細(xì)胞的G1期，促進(jìn)其進(jìn)入S期，并加速OSCC細(xì)胞的增殖。

IRF-4結(jié)合蛋白；口腔鱗癌；增殖；cyclin D1

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)位居人類十大惡性腫瘤第6位，是全世界常見腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的2%～3%，全世界每年有約50萬新增病例，并呈逐年升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的健康[1-2]。由于對(duì)OSCC的病因及發(fā)病機(jī)制不甚清楚，在過去的幾十年中，OSCC患者的5年生存率仍無明顯改善。因此，深入研究OSCC的分子機(jī)制，尋找新的OSCC的治療靶標(biāo)具有十分重要的意義。本課題前期的研究發(fā)現(xiàn)IRF-4結(jié)合蛋白(IBP)高表達(dá)于OSCC，其表達(dá)與OSCC的腫瘤大小、臨床TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與OSCC的分化呈負(fù)相關(guān)[3]。并且通過MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成試驗(yàn)法證實(shí)，上調(diào)IBP表達(dá)能促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖[4]。但I(xiàn)BP促進(jìn)OSCC增殖的機(jī)制還不清楚，因此，本研究擬探尋其中的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 Tca8113口腔鱗癌細(xì)胞株購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)；IBP過表達(dá)的口腔鱗癌細(xì)胞株 Tca8113/IBP及空質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞Tca8113/C1由本課題前期實(shí)驗(yàn)建立并保存[4]。胎牛血清，1640(高糖)培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO/BRL公司；胰酶消化液購(gòu)自碧云天；鼠抗人cyclin D1單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗人cyclin E 多克隆抗體購(gòu)自Biosynthesis公司；兔抗人p27kip1多克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Biosynthesis公司；羊抗鼠IgG或羊抗兔二抗購(gòu)自碧云天。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113、Tca8113/IBP、Tca8113/C1培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布 將培養(yǎng)5代后的Tca8113/IBP、Tca8113、Tca8113/C1細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為1×106/孔，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。用0.25%胰酶消化，采集細(xì)胞吹打制備成單細(xì)胞懸液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 ml 4 ℃預(yù)冷的PBS重新懸浮細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清。加入300 μl預(yù)冷的PBS重新懸浮細(xì)胞，一邊振蕩一邊逐滴加入1 ml 70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃避光過夜。檢測(cè)時(shí)加入終濃度為50 μg/ml的RNA酶，37 ℃反應(yīng)1 h。然后再加入100 μg/ml碘化丙啶溶液，染色20～30 min后，在流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)上進(jìn)行檢測(cè)。增殖指數(shù)(PI)的計(jì)算參考文獻(xiàn)[5]，PI=(S+G2)/(S+G2+G1)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次的均數(shù)。

1.4 Western blotting測(cè)蛋白cyclin D1、cyclin E和P27kip1的表達(dá) 將Tca8113/IBP、Tca8113、Tca8113/C1細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為1×106/孔，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別提取3組細(xì)胞蛋白，蛋白提取方法：細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期、鋪滿培養(yǎng)瓶底約70%～90%后，以冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以吸管及濾紙吸盡液體后置冰上保存，取RIPA(強(qiáng))裂解液(碧云天)，按照每1 ml裂解液中加入10 μl以異丙醇溶解的100 mM 的PMSF(碧云天)，混勻后以300 μl/100 ml培養(yǎng)瓶的比例加入裂解細(xì)胞，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使裂解液充分接觸細(xì)胞，置冰上放置約15 min后，以細(xì)胞刮收集細(xì)胞至1.5 ml EP管，以1 ml一次性注射器反復(fù)吹打裂解液約20次，使DNA斷裂，4 ℃ 14 000 r/min離心15 min后收集上清，取10 μl樣品用于蛋白濃度測(cè)定(BCA法)，其余蛋白加入適量上樣緩沖液，于水浴中煮沸5 min后分裝，置-80 ℃保存?zhèn)溆?。將上述提取的蛋白加熱煮沸變性，?jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后分別與cyclin D1、cyclin E和P27kip1一抗(1∶200)結(jié)合，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔二抗結(jié)合，顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 IBP表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：36.40%的Tca8113/IBP細(xì)胞被阻滯在G1期，而52.00% 的Tca8113細(xì)胞和51.35%的Tca8113/C1細(xì)胞被阻滯在G1期，Tca8113/IBP被阻滯在G1期的細(xì)胞較Tca8113和Tca8113/C1少(P<0.05，圖1)。提示IBP能縮短OSCC細(xì)胞的G1期，促進(jìn)其進(jìn)入S期，從而加快OSCC的增殖。通過計(jì)算各組增殖指數(shù)顯示，Tca8113/IBP增殖指數(shù)為0.636，而Tca8113和Tca8113/C1的增殖指數(shù)分別為0.480和0.487，提示上調(diào)IBP表達(dá)能促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖能力。

圖1 IBP表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞周期的影響

2.2 IBP表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步探尋IBP縮短OSCC細(xì)胞周期G1期促進(jìn)其進(jìn)入S期的機(jī)制，本研究檢測(cè)了部分在細(xì)胞周期中調(diào)控細(xì)胞從G1期到S期中起關(guān)鍵作用的蛋白，其中包括cyclin D1、cyclin E和P27Kip1。結(jié)果顯示：Tca8113/IBP組細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)高于其他兩組，而cyclin E和P27Kip1在各組細(xì)胞中的表達(dá)未見明顯變化(圖2)。由于cyclin D1在細(xì)胞從G1期到S期的過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，所以結(jié)果提示，IBP可能通過調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá)從而縮短OSCC細(xì)胞的G1期，促進(jìn)其進(jìn)入S期，并加速OSCC細(xì)胞的增殖。

圖2 IBP表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及增殖至關(guān)重要，雖然OSCC的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但細(xì)胞周期的失控導(dǎo)致異常增殖是最常見的分子機(jī)制。為探討IBP促進(jìn)OSCC增殖的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：上調(diào)IBP表達(dá)組細(xì)胞較空質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的G1期細(xì)胞含量少，提示IBP能縮短OSCC細(xì)胞的G1期促進(jìn)其進(jìn)入S期，從而加快OSCC的增殖。在細(xì)胞周期中，G1/S、G2/M和M期3個(gè)檢查點(diǎn)功能的正常發(fā)揮，對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性非常關(guān)鍵，其功能喪失或降低則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期不能及時(shí)停止，從而可能導(dǎo)致腫瘤形成[6]。而在這3個(gè)檢查點(diǎn)之中，G1/S期的失調(diào)最為常見，也尤為重要。細(xì)胞在該檢測(cè)點(diǎn)對(duì)DNA損傷以及各類生長(zhǎng)分裂原等復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)進(jìn)行整合與傳遞，最終決定細(xì)胞分裂與否，決定其發(fā)生凋亡或退出細(xì)胞周期而進(jìn)入G0期，確保遺傳信息的準(zhǔn)確無誤[7-8]。

在G1向S期轉(zhuǎn)換的過程中，受到多種蛋白和機(jī)制的調(diào)控，本研究采用Western blotting檢測(cè)cyclin D1、cyclinE和P27Kip1在各組細(xì)胞中表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：Tca8113/IBP組細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)高于Tca8113和Tca8113/C1組，而cyclin E和 P27Kip1在各組細(xì)胞中的表達(dá)未見明顯變化。提示IBP可能通過調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá)從而縮短OSCC細(xì)胞的G1期，促進(jìn)其進(jìn)入S期，并加快OSCC細(xì)胞的增殖。雖然既往報(bào)道表明，Rac1可以通過提高cyclin D1的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤的增殖，并且促進(jìn)細(xì)胞的惡變[9-10];RhoA可以調(diào)節(jié)cyclin D1和P27Kip1的表達(dá)從而調(diào)控腫瘤的增殖[11];Cdc42同樣也可以通過調(diào)節(jié)有絲分裂過程中染色體分離，進(jìn)而影響細(xì)胞周期[12]；但I(xiàn)BP具體是如何調(diào)控cyclin D1表達(dá)的還需進(jìn)一步研究。

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Effects of IRF-4 binding protein(IBP)on proliferation of OSCC cells

Pan Lei1,Jian Congxiang2,Li Zhuo2,Huang Xiaoshan3

1.Department of Stomatology,Hospital 85 of PLA,Shanghai,200050,China;2.Department of Stomatology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;3.The First Affiliated Hospital to Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan,610500,China

Objective To observe the potential effects of IRF-4 binding protein(IBP)on the proliferation of OSCC cells.Methods FACS analysis assay was applied to investigate the effects of over-expressed IBP on the cell cycling of Tca8113,Tca8113/C1 and Tca8113/IBP,while Western blotting assay was applied to detect the protein expression in related cell cycles.Results FACS analysis assay showed that IBP shortened the G1/S phase of OSCC and fastened its proliferation;the expression of cyclin D1 in Tca8113/IBP was stronger than those in Tca8113 and Tca8113/C1,while no significant differences were observed in the expression of cyclin E and P27kip1.Conclusions IBP may shorten the G1/S phase of OSCC and fasten its proliferation by regulating the expression of cyclin D1.

IRF-4 binding protein(IBP)；oral squamous cell carcinoma；cell proliferation；cyclin D1

四川省教育廳科研資助項(xiàng)目(11ZB204)

200050 上海，解放軍85醫(yī)院口腔科(潘 磊)；成都軍區(qū)總醫(yī)院附屬口腔醫(yī)院(簡(jiǎn)從相，李 卓);成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科(黃曉山)

黃曉山，電話:028-83016726；E-mail:hss1224@126.com

R 739.8

A

1004-0188(2014)05-0468-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.05.002

2013-08-26)