李兆永，陳軍輝，王 帥，張茹潭，史 倩，2，鄭 立，王小如,3

(1. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所，海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061；2. 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100；3. 廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361005)

麻痹性貝毒素電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式分析特征

李兆永1，陳軍輝1，王 帥1，張茹潭1，史 倩1，2，鄭 立1，王小如1,3

(1. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所，海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061；2. 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100；3. 廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361005)

利用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)8種常見(jiàn)麻痹性貝毒素(GTX1, GTX 4, GTX2, GTX 3, dcGTX2, dcGTX3, C1和C2)在電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式下的分析特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明:8種目標(biāo)化合物在一級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中均易失去1個(gè)H，形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰(基峰)；在二級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中，各化合物的母離子([M-H]-)主要通過(guò)丟失-H2O和-NHCO等中性碎片，形成穩(wěn)定的特征子離子峰，并且同分異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖有差異，可為含硫麻痹性貝毒素的二級(jí)質(zhì)譜定性、定量分析提供依據(jù)。此外，對(duì)各目標(biāo)化合物二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片峰進(jìn)行三級(jí)質(zhì)譜分析，對(duì)產(chǎn)生的主要特征碎片峰進(jìn)行歸屬，并推測(cè)裂解途徑。本研究可為電噴霧質(zhì)譜在負(fù)離子模式下檢測(cè)含硫麻痹性貝毒素提供參考和依據(jù)。

麻痹性貝毒素；電噴霧質(zhì)譜；裂解途徑

麻痹性貝毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)是赤潮毒素中毒性最大、發(fā)生毒害事件最多、影響人類(lèi)最為嚴(yán)重的一類(lèi)毒素，食入少量的PSP毒素即可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)麻痹，甚至死亡[1]。麻痹性貝毒素是四氫嘌呤的衍生物，沒(méi)有紫外吸收，易溶于水，但不溶于非極性有機(jī)溶劑[2]。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的PSP毒素有20多種，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中R4基團(tuán)的不同，可將其分為4類(lèi)：1)氨基甲酸酯類(lèi)毒素(carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝溝藻毒素1-4(GTX1-4)；2)N-磺酰氨甲酰基類(lèi)毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括B1-2、C1-4；3)脫氨甲?；?lèi)毒素(decarbamoyl toxins)，包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4；4)脫氧脫氨甲?；?lèi)毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括dodcSTX、dodcGTX2、3等[3]。

近年來(lái)，液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為海產(chǎn)品和藻體中PSP檢測(cè)的先進(jìn)方法之一。采用電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)PSP的現(xiàn)有文獻(xiàn)均為正離子(ESI+)模式，存在方法靈敏度低的缺點(diǎn)[4-10]。而采用電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式檢測(cè)PSP毒素的研究未見(jiàn)報(bào)道，負(fù)離子模式下的PSP質(zhì)譜分析裂解規(guī)律也尚未闡明。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20多種PSP毒素中，約有65%PSP毒素含有OSO3-基團(tuán)，對(duì)于含有此基團(tuán)的化合物而言，理論上更適合ESI負(fù)離子模式檢測(cè)。本研究分別采用ESI+和ESI-兩種模式，對(duì)含OSO3-基團(tuán)的8種常見(jiàn)的PSP毒素：PSPGTX1、4(R4=COONH2)，GTX2、3(R4=COONH2)，dcGTX2、3(R4=OH)和C1、2(R4=COONHSO3-)(均為同分異構(gòu)體)進(jìn)行分析比較，在負(fù)離子模式下進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律研究，并對(duì)其碎片峰進(jìn)行歸屬，以期為液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法(ESI-模式)測(cè)定含S麻痹性貝毒素提供依據(jù)。

這種微服公訪的有效性已經(jīng)見(jiàn)之于各地的工作實(shí)踐。諸如廣東省在“打傘”懲惡時(shí)，省、市、縣三級(jí)的紀(jì)委監(jiān)委暗訪組分兵行動(dòng)，拍攝了大量的黑惡勢(shì)力的視頻現(xiàn)場(chǎng)和百姓的控訴，為快刀斬亂麻地掃黑除惡提供了鐵證。專(zhuān)項(xiàng)斗爭(zhēng)第一輪督導(dǎo)的其他省、區(qū)、市，用類(lèi)似的工作方法獲得了當(dāng)?shù)睾趷簞?shì)力對(duì)無(wú)辜百姓刀捅電擊、鎬把斷腿等殘忍迫害行徑的一手材料，獲得了黑惡勢(shì)力廣布耳目、操縱選舉的一手材料，獲得了黑惡勢(shì)力盜墓掘墳、偷運(yùn)文物的一手材料，獲得了黑惡勢(shì)力非法拘禁、涉槍涉爆的一手材料，讓各種黑惡勢(shì)力及其“保護(hù)傘”感到末日已近。

在農(nóng)村水利領(lǐng)域，分別針對(duì)農(nóng)田節(jié)水與灌溉、大型灌區(qū)泵站改造、農(nóng)村飲水安全及農(nóng)村小水電等，引進(jìn)95項(xiàng)技術(shù)，創(chuàng)新轉(zhuǎn)化產(chǎn)品120項(xiàng)，實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化儀器和設(shè)備36項(xiàng)，開(kāi)發(fā)軟件22套，集成系統(tǒng)21個(gè)，取得專(zhuān)利17項(xiàng)，成果在249個(gè)工程中得到成功應(yīng)用，有效促進(jìn)了農(nóng)村水利發(fā)展，對(duì)新農(nóng)村建設(shè)起到了積極的推進(jìn)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器等；6320型離子阱質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有電噴霧(ESI)離子源；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

2組患者術(shù)后1周和末次隨訪時(shí)Cobb角較術(shù)前均明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）。術(shù)前和術(shù)后1周Cobb角2組間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），末次隨訪時(shí)B組Cobb角顯著小于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）。末次隨訪時(shí)，B組Cobb角丟失1.22°±0.34°，A組丟失5.62°±1.16°，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）。

在各化合物一級(jí)質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，以準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰為母離子，進(jìn)行ESI-MS2分析，結(jié)果示于圖2。下面將對(duì)各PSP同分異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜分析特征進(jìn)行逐一討論。GTX1和GTX4的ESI-MS2分析主要得到m/z367、349子離子峰。m/z367子離子峰均為基峰，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子m/z410的R4基團(tuán)失去中性碎片-NHCO而形成的[M-H-43]-子離子峰。由于m/z367子離子峰豐度高、穩(wěn)定性好，故在GTX1&4定量分析中可選為定量離子。推測(cè)m/z349的子離子峰為母離子失去中性碎片-H2O-NHCO而形成的[M-H-61]-子離子峰。通過(guò)比較GTX4與GTX1的二級(jí)質(zhì)譜圖可以看出，在GTX4的二級(jí)質(zhì)譜圖中還可觀察到明顯的m/z392子離子峰，推測(cè)為母離子12位C失去一分子水所生成的[M-H-18]-子離子峰。由此可知，在ESI-二級(jí)質(zhì)譜分析中，GTX4母離子比GTX1更易產(chǎn)生穩(wěn)定的失水峰，這可作為區(qū)分這對(duì)同分異構(gòu)體的質(zhì)譜特征指標(biāo)。

1.2對(duì)照品溶液的配制

用0.1 mol/L 乙酸稀釋毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各組分的濃度分別為：GTX1(0.124 mg/L)、GTX2(0.226 mg/L)、GTX3(0.086 mg/L)、GTX4(0.041 mg/L)、dcGTX2(0.205 mg/L)、dcGTX3(0.046 mg/L)、C1(0.270 mg/L)和C2(0.083 mg/L)。

1.3親水作用色譜-電噴霧質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件 Waters Atlantis HILIC Silica色譜柱(2.1 m×150 mm×3 μm)；流動(dòng)相：A為水，B為95%乙腈(含有5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；室溫20～25 ℃；梯度洗脫程序：時(shí)間為0—5—33—35 min，B%為100%—100%—89.8%—80%。

1.3.2質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式(ESI-)，掃描范圍m/z100～500，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，噴霧氣壓241.3 kPa，毛細(xì)管電壓4.5 kV，裂解電壓120 V，錐孔電壓60 V。

2 結(jié)果與討論

2.1PSP毒素ESI-MS，ESI-MS2質(zhì)譜分析特征

GTX2和GTX3在ESI-MS2分析中主要得到m/z376、351、333子離子峰，分別為準(zhǔn)分子離子m/z394失去中性碎片-H2O，-NHCO和-H2O-NHCO所形成的子離子峰。在GTX2的二級(jí)質(zhì)譜圖中，m/z351的子離子峰為基峰，子離子峰m/z376，333豐度均較低；而GTX3的二級(jí)質(zhì)譜圖與GTX2差異明顯，其中m/z376子離子峰為基峰，m/z351、333子離子峰豐度也相對(duì)較高。這兩種化合物(同分異構(gòu)體)在二級(jí)質(zhì)譜分析中檢測(cè)到的子離子差異明顯，可用于該化合物的區(qū)分。GTX2定量離子可選用m/z394>m/z351，而GTX3的定量離子可選用m/z394>m/z376。

麻痹性貝毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(CRM-GTX1&4-c，CRM-GTX2&3-c，CRM-dcGTX2&3-c，CRM-C1&2等)：加拿大國(guó)家海洋研究中心產(chǎn)品。

甲酸(色譜純)和甲酸銨(優(yōu)級(jí)純)：瑞士Fluka公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；超純水：由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

圖1 負(fù)離子模式下8種PSP毒素一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

分別采用ESI+和ESI-全掃描對(duì)8種常見(jiàn)含OSO3-基團(tuán)的PSP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這8種PSP化合物(兩兩為同分異構(gòu)體)在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但是在負(fù)離子模式下的靈敏度明顯好于正離子模式，靈敏度約為正離子模式的2～10倍。8種常見(jiàn)含OSO3-基團(tuán)PSP毒素在負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖示于圖1。由圖1可見(jiàn)：8種PSP化合物在負(fù)離子模式下均易失去1個(gè)H，形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰(基峰)，各化合物m/z分別為GTX1和GTX4：410，GTX2和GTX3：394，dcGTX2和dcGTX3：351，C1和C2：474；在一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)[2M-H]-峰，且[M-H]-峰穩(wěn)定性較好，一級(jí)質(zhì)譜圖上未見(jiàn)明顯的碎片峰，各組同分異構(gòu)體的一級(jí)質(zhì)譜圖并無(wú)明顯差異。

dcGTX2和dcGTX3在ESI-MS2分析中主要得到m/z333子離子峰(基峰)，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子m/z351的12位C上失去一分子水，可選用m/z351>m/z333作為檢測(cè)離子，用于dcGTX2和dcGTX3的定量測(cè)定。比較dcGTX2和dcGTX3的二級(jí)質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，兩者有一定的差異，可通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分析對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。

5) 遠(yuǎn)程維護(hù)：當(dāng)需要對(duì)變電站防誤數(shù)據(jù)進(jìn)行維護(hù)時(shí)，無(wú)需在變電站進(jìn)行維護(hù)，調(diào)控中心工作站可實(shí)現(xiàn)對(duì)五防系統(tǒng)內(nèi)任一變電站防誤數(shù)據(jù)遠(yuǎn)程維護(hù)工作，避免維護(hù)滯后性，降低數(shù)據(jù)更新備份工作量。

C1和C2在ESI-MS2分析中主要得到m/z456、351、431、413、394的子離子峰?；鍨閙/z456子離子，推測(cè)為母離子12位C上失去一分子水，可選用其作為檢測(cè)子離子進(jìn)行C1和C2的定量測(cè)定。子離子峰m/z351推測(cè)為母離子R4基團(tuán)失去碎片-SO3-NHCO；m/z431子離子峰推測(cè)為母離子失去中性碎片-NHCO，進(jìn)一步失去一分子水生成m/z413碎片峰；m/z394子離子峰推測(cè)為母離子失去碎片-SO3形成的子離子峰。

圖2 負(fù)離子模式下8種PSP毒素二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

摘 要：在小學(xué)教學(xué)的過(guò)程中，語(yǔ)文是教師比較重視的學(xué)科之一。開(kāi)展閱讀教學(xué)能夠有效培養(yǎng)學(xué)生的文學(xué)素養(yǎng)，提升學(xué)生的語(yǔ)文實(shí)踐能力以及綜合能力。但是對(duì)于學(xué)生來(lái)說(shuō)，由于其自身的思維、分析能力還不成熟，所以閱讀教學(xué)的難度較高。因此，在具體的教學(xué)過(guò)程中，教師可以借助信息技術(shù)開(kāi)展閱讀教學(xué)，激發(fā)學(xué)生的閱讀興趣，從而提升其綜合能力。

2.2PSP毒素ESI-MS3質(zhì)譜分析及裂解規(guī)律

在多級(jí)質(zhì)譜分析中，對(duì)子離子信號(hào)強(qiáng)度影響最大的是碎裂振幅。如果碎裂振幅過(guò)高，母離子完全碎裂；如果碎裂振幅過(guò)低，母離子沒(méi)有碎裂或子離子碎片過(guò)少，不便對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[11]。以各目標(biāo)化合物在ESI-MS2分析中得到的豐度最大的離子峰為三級(jí)質(zhì)譜分析母離子，通過(guò)逐漸加大碎裂振幅，比較不同碎裂振幅條件下的三級(jí)質(zhì)譜圖，從而確定最佳的三級(jí)質(zhì)譜分析條件，8種化合物的三級(jí)質(zhì)譜圖示于圖3。

從圖3可以看出，GTX1和GTX4三級(jí)質(zhì)譜圖均主要得到m/z349離子，推測(cè)為m/z367離子峰失去一分子H2O所生成m/z349離子峰。GTX2和GTX3三級(jí)質(zhì)譜圖都得到m/z333離子峰，但裂解途徑不同；GTX2為m/z351離子峰失去一分子H2O生成m/z333離子峰；GTX3為m/z376離子峰失去中性碎片-NHCO生成m/z333離子峰。dcGTX2和dcGTX3 ESI-MS3質(zhì)譜圖主要得到m/z253、235、274離子峰，為m/z333離子峰分別失去-SO3、-SO3-H2O、-NH3-HNCNH所生成；dcGTX2的m/z333離子峰還可失去-NH3生成m/z316離子峰，失去-HNCNH生成m/z291離子峰；而dcGTX3的三級(jí)質(zhì)譜圖中并無(wú)m/z316和m/z291離子產(chǎn)生。C1和C2三級(jí)質(zhì)譜圖均得到m/z413、376、333離子峰，為m/z456離子峰分別失去-NHCO、-SO3、-SO3-NHCO所生成，C1的m/z413離子峰還可失去一分子水生成m/z395碎片峰，C2無(wú)碎片m/z395離子生成。

圖3 負(fù)離子模式下8種PSP毒素三級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS3 spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

通過(guò)比較各化合物結(jié)構(gòu)和多級(jí)質(zhì)譜信息發(fā)現(xiàn)：GTX1～GTX4多級(jí)質(zhì)譜分析碎片峰較少，均可失去中性碎片-NHCO和-H2O，三級(jí)質(zhì)譜峰均為失去碎片-NHCO-H2O所形成，且豐度較高，說(shuō)明子離子[M-H-43-18]-結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定。而dcGTX2和dcGTX3二級(jí)質(zhì)譜分析得到的基峰恰為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的m/z333離子峰，其它二級(jí)碎片離子較少。dcGTX2、dcGTX3、C1、C2的三級(jí)質(zhì)譜分析碎片離子較多，豐度都很低，且這4種化合物都可失去-SO3中性碎片。8種化合物多級(jí)質(zhì)譜分析產(chǎn)生的碎片離子列于表1，推測(cè)得出的各化合物多級(jí)質(zhì)譜分析裂解途徑示于圖4。

表1 8種麻痹性貝毒素多級(jí)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

采用電噴霧質(zhì)譜在負(fù)離子模式下測(cè)定8種常見(jiàn)含硫PSP毒素，其靈敏度明顯高于正離子模式，離子穩(wěn)定性較好，且能提供較豐富的碎片信息。8種含硫PSP毒素在負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中均易失去1個(gè)H，形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰(基峰)，且同分異構(gòu)體的一級(jí)質(zhì)譜圖無(wú)明顯差異；在二級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中,各PSP毒素的母離子([M-H]-)主要通過(guò)丟失-H2O和-NHCO的中性碎片，形成穩(wěn)定的特征子離子峰，并且同分異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖有差異。GTX1～GTX4的三級(jí)質(zhì)譜分析碎片峰較少，三級(jí)質(zhì)譜基峰均為失去碎片-NHCO-H2O所形成，且豐度較高。dcGTX2、dcGTX3、C1、C2的三級(jí)質(zhì)譜分析碎片離子較多，豐度很低，且這4種化合物都可失去-SO3中性碎片。在此基礎(chǔ)上，對(duì)這8種含硫PSP毒素的多級(jí)質(zhì)譜分析裂解途徑進(jìn)行了推測(cè)，其結(jié)果可為電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式定性、定量分析常見(jiàn)含硫PSP毒素提供依據(jù)。

圖4 8種PSP毒素質(zhì)譜分析裂解途徑Fig.4 Fragment pathways of eight PSP toxins for MS analysis

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MSCharacteristicofParalyticShellfishPoisoningToxinsDetectedbyElectrosprayIonizationMassSpectrometryinNegativeIonMode

LI Zhao-yong1, CHEN Jun-hui1, WANG Shuai1, ZHANG Ru-tan1, SHI Qian1,2, ZHENG Li1, WANG Xiao-ru1,3

(1.ResearchCenterforMarineEcology,TheFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao266061,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China; 3.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

The MS characteristic of eight common paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins (GTX1, GTX4, GTX2, GTX3, dcGTX2, dcGTX3, C1 and C2) were investigated by electrospray ionization multi-stage mass spectrometry (ESI-MSn) in negative ion mode. The results show that the quasi-molecular ion peak [M-H]-(base peak) of each PSP toxin is detected by ESI-MS. Stability characteristic fragment ions are observed by the neutral loss of -H2O and -NHCO for ESI-MS2detection， and the MS2spectra of PSP toxin isomers are different, which can provide experimental basis for qualitative and quantitative determination of sulfur containing PSP toxins by ESI-MS2. ESI-MS3detection is performed for the main characteristic fragment ions of the target toxins produced during ESI-MS2analysis. The main MS3characteristics of the fragment routes are also discussed. This study can help to offer the reference and basis for determination of sulfur containing PSP toxins by electrospray ionization mass spectrometry in negative ion mode.

fragmentation pathway; electrospray mass spectrometry; paralytic shellfish poisoning

2013-05-24；

：2013-07-02

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2007AA092001-10)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAK12B00)；上海市科委科研計(jì)劃項(xiàng)目(11dz1204706)資助

李兆永(1984～)，男(漢族)，山東人，助理工程師，環(huán)境科學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: lizhaoyong2056@126.com

陳軍輝(1978～)，男(漢族)，河北人，副研究員，海洋化學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: jhchen@fio.org.cn

O 657.63

：A

：1004-2997(2014)01-0008-08

10.7538/zpxb.2014.35.01.0008