鐘其頂，王道兵，熊正河

(1. 天津科技大學，天津 300457；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京 100027)

固態(tài)法白酒與固液法白酒的同位素鑒別技術

鐘其頂1,2,3，王道兵2,3，熊正河2,3

(1. 天津科技大學，天津 300457；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京 100027)

固態(tài)法白酒和固液法白酒的鑒別是當前白酒行業(yè)所面臨的技術難題。本實驗以碳穩(wěn)定同位素為指標，建立了氣相色譜-燃燒-同位素質譜(GC-C-IRMS)聯(lián)用方法測定白酒中乙醛、乙醇、丙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯等主要揮發(fā)性物質中的δ13C。測定了43個傳統(tǒng)固態(tài)法白酒樣品，其乙醇δ13C分布范圍為(-17.65±1.31)‰，測定了24個流通領域白酒樣品，其乙醇δ13C分布范圍為(-15.30±1.41)‰，經(jīng)t檢驗分析，二者存在顯著性差異(P<0.01)；t檢驗結果還表明，傳統(tǒng)固態(tài)法白酒樣品和流通領域白酒樣品中異戊醇和乳酸乙酯中δ13C也存在顯著差異。模擬實驗發(fā)現(xiàn)，白酒中乙醇δ13C與添加玉米酒精含量呈正相關關系；添加的玉米酒精和揮發(fā)性香氣物質會改變白酒中的乙醇及微量組分的穩(wěn)定碳同位素比值，因此穩(wěn)定同位素技術將有望成為固態(tài)法白酒和固液法白酒的有效鑒別手段。

氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜(GC-C-IRMS)；固態(tài)法白酒；固液法白酒；δ13C；乙醇

白酒是具有悠久歷史的中國特色傳統(tǒng)食品，憑借獨特的固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)蒸餾傳統(tǒng)釀造技術成為世界六大蒸餾酒之一。隨著社會發(fā)展，白酒行業(yè)出現(xiàn)成本較低，自動化程度較高的液態(tài)酒精工藝，通過串蒸、調香和固液法結合等方式生產(chǎn)新工藝白酒，簡稱固液法白酒[1]。相對傳統(tǒng)固態(tài)法白酒而言，固液法白酒允許使用食用酒精、香氣和香味等物質調整成品酒質量，過程控制、生產(chǎn)技術、品質質量和產(chǎn)品成本均明顯低于傳統(tǒng)固態(tài)法白酒。為了保護消費者權益，國家標準明確規(guī)定，凡采用新工藝生產(chǎn)的白酒需要明確標注執(zhí)行固液法白酒的國家標準，以示區(qū)別傳統(tǒng)固態(tài)法白酒。但由于目前缺乏固態(tài)法和固液法白酒有效鑒別的配套方法標準，部分不法企業(yè)為了利益最大化，將新工藝(固液法)白酒冒充傳統(tǒng)固態(tài)法白酒進行銷售，嚴重干擾了白酒行業(yè)的市場秩序。因此，鑒定固態(tài)法白酒和固液法白酒是當前白酒行業(yè)中亟待解決的技術難題[2]。

同位素質譜技術在食品成分摻假鑒別方面具有其他化學檢測不可比擬的技術優(yōu)勢，現(xiàn)已成功用于果汁摻糖[3-5]、摻水[6-7]分析，葡萄酒摻劣質酒[8-11]分析，橄欖油產(chǎn)地鑒別[12-15]，蜂蜜摻糖[16-17]分析奶制品真實性鑒別[18-20]等方面。本研究采用氣相色譜-燃燒-同位素質譜(GC-C-IRMS)聯(lián)用技術測定白酒中微量揮發(fā)性組分和乙醇中的δ13C，通過固態(tài)法白酒和固液法白酒中微量揮發(fā)性組分及乙醇之間13C同位素比值的差異分析，探討固態(tài)白酒和固液法白酒鑒別技術的可行性。

1 實驗部分

1.1主要儀器

Triplus自動進樣器，Trace GC氣相色譜儀，燃燒轉化裝置，Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質譜儀：均為美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑

實驗室標準物質：乙醛、乙醇、丙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯，均為色譜純，且δ13CVPDB均通過EA-IRMS標定(參考物質為IAEA-CH-6和NBS-22)；氦氣(純度>99.999%)；乙醇(國產(chǎn)色譜純)。

1.3色譜條件

1.3.1白酒揮發(fā)性物質δ13C(不包括乙醇)的測定 Wax毛細色譜柱；GC進樣口溫度200 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)，恒流模式(1.2 mL/min)；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升溫至200 ℃；進樣量0.5 μL。

1.3.2白酒中乙醇δ13C的測定 Wax毛細色譜柱；GC進樣口溫度200 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)，恒流模式(1.2 mL/min)；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至80 ℃，然后以15 ℃/min升溫至200 ℃；進樣量0.7 μL。

1.4轉化條件

燃燒轉化裝置(IsoLink)中配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度1 000 ℃，將乙醇、異戊醇等有機物轉化成CO2。

1.5白酒樣品

1.5.1傳統(tǒng)固態(tài)法白酒 從白酒廠獲得43個某香型以高粱為主要原料的傳統(tǒng)工藝白酒基礎酒樣品，建立該香型固態(tài)法白酒參考樣品庫。

1.5.2流通領域白酒 從市場流通領域購買24個同一香型以高粱為主要原料的白酒樣品，其中部分樣品價格較低，疑似為采用固液法新工藝生產(chǎn)的白酒樣品。

1.6樣品前處理

將白酒樣品轉移至進樣小瓶，按1.3.1條件測定白酒中乙醛、丙醇、異丁醇和乳酸乙酯的穩(wěn)定同位素13C(δ13C)比值。

吸取20 μL白酒樣品于進樣小瓶，加入1.5 mL丙酮溶液，混勻，按1.3.2條件測定白酒樣品中乙醇δ13C比值。

1.7結果表示

采用相對測量法表示樣品中13C/12C，結果以δ(千分差，‰)表示：

δ13C=(R樣品/R標準-1)×1 000

其中，R樣品為樣品中13C與12C的比值；R標準為標

準物質V-PDB中13C與12C比值，13C/12C=(11 237.2±90)×10-6。

2 結果與討論

2.1測定方法

根據(jù)1.3和1.4設定的GC-C-IRMS各項參數(shù)，同一白酒樣品經(jīng)不同前處理后，分別測定乙醇及各種揮發(fā)性成分，其離子流圖分別示于圖1和圖2。圖1表明，采用丙酮作為有機溶劑測定白酒中乙醇44的離子峰強度在4 V左右，符合同位素質譜1～10 V線性測定范圍。由圖2可見，白酒中乙醛、乙酸乙酯、甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇和乳酸乙酯44離子峰強度均處于同位素質譜1～10 V線性測定范圍，并具有較好分的離度。

2.2白酒中乙醇δ13C分布情況

測定了43個某香型傳統(tǒng)固態(tài)法白酒樣品和24個流通領域同一香型白酒樣品中乙醇δ13C(‰)，結果示于圖3和圖4。

圖1 GC-C-IRMS測定白酒中乙醇44,45,46的離子流圖 Fig.1 Ions chromatography of ethanol 44,45,46 in Chinese spirit determinated by GC-C-IRMS

圖2 GC-C-IRMS測定白酒中揮發(fā)性風味物質44,45,46的離子流圖Fig.2 Ions chromatography of volatile flavors 44,45,46 in Chinese spirit determinated by GC-C-IRMS

圖3 傳統(tǒng)固態(tài)法白酒乙醇δ13C頻率直方圖 Fig.3 Frequency descriptive statistics chart of δ13C of ethanol of traditional Chinese spirit

圖4 流通領域白酒樣品乙醇δ13C頻率直方圖 Fig.4 Frequency descriptive statistics chart of δ13C of ethanol of Chinese spirit in market

由圖3可見，傳統(tǒng)固態(tài)法白酒乙醇δ13C均值為-17.65‰，標準偏差為1.31；由圖4可見，流通領域白酒樣品乙醇δ13C均值為-15.30‰，標準偏差為1.41。兩種樣品乙醇的13C/12C比值Test差異性檢驗結果列于表1，二者的乙醇δ13C存在顯著性差異(雙側檢驗Sig小于0.01)。根據(jù)工作經(jīng)驗，在白酒行業(yè)中，一些企業(yè)雖然采用添加部分玉米酒精的固液法白酒工藝生產(chǎn)白酒，但考慮到消費者更傾向選擇固態(tài)法白酒的消費心理，未按照GB10344—2005《預包裝飲料酒標簽通則》進行如實標注，而以僥幸心理虛假標注的傳統(tǒng)固態(tài)法的香型白酒國家標準。為了進一步證實以上假設，開展了在固態(tài)法白酒中添加玉米酒精的實驗分析。

表1 固態(tài)法白酒樣品和流通領域白酒樣品乙醇的13C/12C比值Test差異性檢驗結果Table 1 Test results of 13C/12C of ethanolbetween traditional Chinese spirit and Chinese spirit in market

2.3添加玉米酒精對傳統(tǒng)固態(tài)法白酒中乙醇δ13C的影響

根據(jù)固液法白酒生產(chǎn)特點和43個傳統(tǒng)固態(tài)法白酒中乙醇δ13C分布，從中心處挑選代表性白酒樣品A(乙醇δ13C為-17.08)，向其中分別添加30%、50%玉米酒精(體積比)，獲得不同乙醇添加量的白酒樣品，測定其乙醇δ13C，結果列于表2。以添加玉米酒精的百分含量為橫坐標，白酒樣品中乙醇的δ13C為縱坐標作圖，示于圖5。

圖5 摻入不同比例玉米酒精的白酒13C/12C變化曲線圖Fig.5 The curve of 13C/12C of ethanol during Chinese spirit mixed different ratio maize ethanol

由表2和圖5可見，添加30%和50%玉米酒精的固態(tài)白酒乙醇13C/12C比值分別為-14.87‰和-14.01‰，明顯偏離固態(tài)法白酒13C/12C比值的正常分布范圍(-17.6±1.3)‰。

結果表明，傳統(tǒng)固態(tài)法白酒和允許添加食用酒精的新工藝固液法白酒中乙醇13C/12C存在顯著性差異，本工作的測定方法有望成為兩種工藝白酒的鑒別依據(jù)。

表2 模擬固液法白酒中乙醇δ13CTable 2 δ13C values of ethanol in Chinese spirit madefrom traditional and liquid fermentation

2.4白酒中其他揮發(fā)性組分δ13C與乙醇δ13C之間的對比分析

為進一步開展傳統(tǒng)固態(tài)法白酒樣品和流通領域白酒樣品之間的差異性分析，本研究將白酒中其他微量揮發(fā)性組分的δ13C比值進行t檢驗分析，結果列于表3。從表3可見，傳統(tǒng)固態(tài)法白酒參考樣品和流通領域白酒之間的異戊醇和乳酸乙酯的δ13C比值存在顯著差異，而乙醛、正丙醇和異丁醇等δ13C比值未見顯著差異。結合2.3和2.4結果分析，流通領域中的白酒(含部分固液法新工藝白酒)除了添加部分玉米食用酒精外，還可能添加其他微量組分，用于改善白酒香氣或口感。

表3 固態(tài)法白酒樣品和流通領域白酒樣品揮發(fā)性組分比值13C/12C差異Test檢驗

3 結論及展望

本工作建立了GC-C-IRMS聯(lián)用方法測定白酒中微量揮發(fā)性組分(乙醛、正丁醇、異戊醇和乳酸乙酯)的δ13C和乙醇的δ13C。

通過固態(tài)法白酒樣品和流通領域白酒樣品之間微量組分碳同位素比值t檢驗發(fā)現(xiàn)，兩者的乙醇、異戊醇和乳酸乙酯的δ13C之間存在顯著差異。

通過添加玉米酒精模擬實驗，驗證了測定乙醇中13C/12C比值的方法用于固態(tài)法白酒和固液法白酒有效鑒別的可行性。

但由于本研究工作是基于某香型以高粱為原料的固態(tài)法白酒樣品和玉米酒精特定樣品范圍內(nèi)的探討性研究，對于多種糧食來源的白酒驗證工作，仍需繼續(xù)開展進一步的研究。

致謝：感謝中國科學院地質與地球物理研究所同位素質譜實驗室張福松老師給予的幫助！

[1] GB/T 20822—2007 固液法白酒[S]. 中國：中國標準化出版社，2007.

[2] 唐永芳. 固態(tài)法白酒的初步鑒別[J]. 釀酒, 2008, 35(1): 97-98. TANG Yongfang. Primary identification of the solid fermentation liquor[J]. Journal of Liquor Making, 2008, 35(1): 97-98(in Chinese).

[3] DONER L W, AJIE H O, STERNBERG L S L, et al. Detecting sugar beet syrups in orange juice by D/H and18O/16O analysis of sucrose[J]. J Agric Food Chem, 1987, 35(4): 610-612.

[4] KELLY S D, RHODES C, LOFTHOUSE J H, et al. Detection of sugar syrups in apple juice byδ2H‰ andδ13C‰ analysis of hexamethylenetetramine prepared from fructose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(7): 1 801-1 806.

[5] KOZIET J, ROSSMANN A, MARTIN G J, et al. Determination of carbon-13 content of sugars of fruit and vegetable juices: A European inter-laboratory comparison[J]. Analytica Chimica Acta, 1993, 271(1): 31-38.

[6] SIMPKINS W A, PATEL G, COLLINS P, et al. Oxygen isotope ratios of juice water in Australian oranges and concentrates[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(7): 2 606-2 612.

[7] JAMIN E, GUERIN R, RETIF M, et al. Impro- ved detection of added water in orange juice by simultaneous determination of the oxygen-18/oxygen-16 isotope ratios of water and ethanol derived from sugars[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2003, 51(18): 5 202-5 206.

[8] CALDERONE G, GUILLOU C. Analysis of isotopic ratios for the detection of illegal watering of beverages[J]. Food Chemistry, 2008, 106(4): 1 399-1 405.

[9] SMEYERS-VERBEKE J, JGER H, LANTERI S, et al. Characterization and determination of the geographical origin of wines. Part II: Descriptive and inductive univariate statistics[J]. Eur Food Res Technol,2009, 230(1):15-29.

[10] 王 琛，趙永剛，姜小燕，等. 紅酒中的87Sr/86Sr同位素比測定[J]. 化學分析計量，2009(18)：21-24. WANG Chen, ZHAO Yonggang, JIANG Xiaoyan, et al. Determination of87Sr/86Sr isotope ratios in wine[J]. Journal of Chemical Analysis and Meterage, 2009,(18)：21-24(in Chinese).

[11] FEDERICA C, LARCHER R, PERINI M, et al. Characterisation of authentic Italian extra-virgin olive oils by stable isotope ratios of C, O and H and mineral composition[J]. Food Chemistry, 2010, 118(4): 901-909.

[12] BIANCHI G, ANGEROSA F, CAMERA L, et al. Stable carbon isotope ratios (13C/12C) of olive oil components[J]. J Agric Food Chem, 1893, 41(11):1 936-1 940.

[13] SPANGENBERG J E, MACKO S A, HUNZIKER J. Characterization of olive oil by carbon isotope analysis of individual fatty acids: Implications for authentication[J]. J Agric Food Chem, 1998, 46(10): 4 179-4 184.

[14] SPANGENBERG J E, OGRINC N. Authentication of vegetable oils by bulk and molecular carbon isotope analyses with emphasis on olive oil and pumpkin seed oil[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(3): 1 534-1 540.

[16] GB/T 18932.1—2002 蜂蜜中碳-4植物糖含量測定方法 穩(wěn)定碳同位素比率法[S]. 北京: 中國標準出版社，2002.

[17] 費曉慶,吳 斌,沈崇鈺,等.液相色譜/元素分析-同位素比值質譜聯(lián)用法鑒定蜂蜜摻假[J]. 色譜, 2011, 29(1): 15-19. FEI Xiaoqing, WU Bin, SHEN Chongyu, et al, Honey adulteration detection using liquid chromatography/elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Chromatography, 2011, 29(1):15-19(in Chinese).

[18] 崔琳琳，劉衛(wèi)國. 碳同位素在不同奶源鑒別中的應用探討[J]. 質譜學報, 2011, 32(3): 164-169. CUI Linlin, LIU Weiguo. The application exploration of carbon stable isotope ratio in identification of fresh milks with different of sources [J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2011, 32(3): 164-169(in Chinese).

[19] CRITTENDENA R G, ANDREWB A S, LEFO- URNOURC M, et al. Determining the geographic origin of milk in Australasia using multi-element stable isotope ratio analysis[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(5):421-428.

[20] CAMIN F, WIETZERBIN K E, CORTES A B, et al. Application of multielement stable isotope ratio analysis to the characterization of French, italian, and spanish cheeses[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(21): 6 592-6 601.

ApplicationofStableIsotopeTechniqueonDistinguishBetweenChineseSpiritbyTraditionalFermentationandChineseSpiritMadefromTraditionalandLiquidFermentation

ZHONG Qi-ding1,2,3, WANG Dao-bing2,3, XIONG Zheng-he2,3

(1.TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China; 2.ChinaNationalInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100027,China; 3.NationalStandardizationCenterofFood&FermentationIndustry,Beijing100027,China)

It is a technical problem in Chinese spirit industry to distinguish between Chinese spirit by traditional fermentation and Chinese spirit made from traditional and liquid fermentation. Methods for the determination ofδ13C values of major volatile substances (such as acetaldehyde, ethanol, isobutanol, isoamyl alcohol, ethyl lactate, etc) in Chinese spirit by gas chromatography combustion coupled to isotopic ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) were developed. The averageδ13C value of ethanol in Chinese spirit made by traditional fermentation is (-17.65±1.31)‰， and the value of what is called traditional Chinese spirit in market is (-15.30±1.41)‰, sot-test result is significant difference(P<0.01). The simulation test show that the carbon isotope ratio of ethanol observed in Chinese spirit are positive relative to those of the corresponding maize ethanol; it is significant differences onδ13C of isoamyl alcohol and ethyl lactate between reference samples and commercial samples. The results show that theδ13C value of ethanol and volatile aroma components in Chinese spirit (made from traditional and liquid fermentation) will be changed when added maize ethanol and exogenous volatile aroma components, so stable isotope technique will be used in distinguish between Chinese spirit made by tracitional fermentation and Chinese spirit made from traditional and liquid fermentation.

gas chromatography-combustion-stable isotope ratio mass spectrometry(GC-C-IRMS); Chinese spirit made by traditional fermentation; Chinese spirit made from traditional and liquid fermentation;δ13C; ethanol

2013-04-02；

：2013-06-04

國家自然科學基金(31101333)；科技部國際合作項目(2011DFA33270)；公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費“雙打”專項項目(2012104009-1)；中國酒業(yè)協(xié)會3C項目資助

鐘其頂(1980～)，男(漢族)，廣西人，高級工程師，從事食品質量與安全標準化技術研究。E-mail:zhongqiding@163.com

熊正河(1957～)，女(漢族)，教授，從事食品標準化技術研究。E-mail: cnscff@263.net

O 657.63

：A

：1004-2997(2014)01-0066-06

10.7538/zpxb.2014.35.01.0066