孫 旸，遲 惠，王 聰，陳 光

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

抗腫瘤19肽為腫瘤抑素（tumstatin）靠近C端的185～203位氨基酸，具有直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［1－2］。運(yùn)用Westem印跡和親和層析法，TracyA，shahan等得到19肽的結(jié)合受體，發(fā)現(xiàn)該肽段是通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的CD47/IAp（integrin associated protein）和αvβ3蛋白結(jié)合而發(fā)揮其作用。它與整合αvβ3、CD47/IAP復(fù)合體結(jié)合后，引起不同細(xì)胞的粘附、趨化以及增生的抑制，但這個(gè)肽段與細(xì)胞之間的作用卻不依賴(lài)于CD47，在CD47不存在的情況下，該肽也可以通過(guò)與αvβ3蛋白的亞單位結(jié)合激活粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和磷脂酸肌醇激酶3（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3），PI 3激酶活化，后激活腺苷酸環(huán)化酶，從而使細(xì)胞內(nèi) cAMP 增加［3－5］。

本實(shí)驗(yàn)將合成的表達(dá)載體pet32a－19肽分別轉(zhuǎn)化到4種不同型號(hào)的大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)［7］，通過(guò)對(duì)其蛋白表達(dá)量分析篩選出高效表達(dá)菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對(duì)其融合抗腫瘤19肽進(jìn)行純化及其復(fù)性，為下一步抗腫瘤19肽活性實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組質(zhì)粒pet32a－19肽，大腸桿菌 DH5α，BL21，BL21（DE3），BL21（DE3）plysS和 Rosetta（DE3） 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理實(shí)驗(yàn)室保存;酵母提取物（YE）、異丙基β－D硫代半乳糖苷（IPTG）和蛋白胨（OXOID） 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒 購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司;實(shí)驗(yàn)中所用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 購(gòu)自TaKaRa公司;Ni Sepharose 6 Fast Flow 購(gòu)自長(zhǎng)春百奧技術(shù)有限公司;其它試劑 國(guó)產(chǎn)分析純。

DYY－2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠;Touching 956凝膠成像系統(tǒng) 上海天呈科技有限公司;JY98－3超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝科器研究所。

1.2 高效表達(dá)菌株的篩選

將重組質(zhì)粒pET32a－19肽分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS，BL21，BL21（DE3）和 Rosetta（DE3）四種感受態(tài)中。分別挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液按1%的比例分別接種至LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入終濃度1mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h。取誘導(dǎo)后菌液離心收集菌體，以誘導(dǎo)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌為陰性對(duì)照，取1mL菌液進(jìn)行 SDS－PAGE電泳，上樣量為10μL，檢測(cè)菌體中蛋白的表達(dá)情況［5］。利用1DGelImageProcessingSoftware（Version 5.0.0.16 US）軟件對(duì)凝膠電泳結(jié)果分析，篩選出重組蛋白表達(dá)量最高的菌株作為工程菌株。

1.3 表達(dá)條件的優(yōu)化

挑取工程菌株接種于含Amp的LB固體培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。按培養(yǎng)基的pH、接種量、IPTG的濃度、IPTG添加時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)［5］，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.1 培養(yǎng)基的 pH 分別配制 pH 為 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5的LB 液體培養(yǎng)基，將種子液按1%的接種量分別接到上述50mL含Amp培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600為 0.6時(shí)，加 IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，180r/min 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。

1.3.2 接種量 將種子液按1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別接至pH為7.0的培養(yǎng)基中，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.3 誘導(dǎo)溫度 誘導(dǎo)溫度分別為 21、25、29、33、37、41℃，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.4 IPTG添加時(shí)間 振蕩培養(yǎng)至其 OD600達(dá)到0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 時(shí)添加 IPTG，其余條件與 1.3.1相同。

1.3.5 IPTG 的濃度 添加 IPTG 至終濃度為 0.1、0.5、1、1.5、2mmol/L，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.6 誘導(dǎo)時(shí)間 分別在 3、4、5、6、7h 后取樣，其余條件與 1.3.1 相同。

把上述的1mL菌液進(jìn)行SDS－PAGE電泳，上樣量為10μL，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況并通過(guò)軟件1D Gel Image Processing Software（Version 5.0.0.16 US）進(jìn)行分析。根據(jù)單因素結(jié)果，選用L18（37）正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將第七個(gè)因素做為空白對(duì)照，因素水平選擇如表1所示。

1.4 融合蛋白可溶性分析

通過(guò)最適條件誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，4℃離心收集菌體。在PBS緩沖溶液中超聲破碎菌體（400W超聲2s間歇4s共100次），4℃離心，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測(cè)，上樣量為10μL。

1.5 融合蛋白的純化和復(fù)性

4℃離心收集1L誘導(dǎo)菌液的菌體，用PBS緩沖溶液清洗菌體兩次，在 buffer1（50mmol/L Tris－HCl，0.2mol/L MEDTA，0.5mol/L NaCl，1%TritonX－100，1mol/L MPMSF，1mg/mL溶菌酶，7%甘油）中超聲破碎菌體（400W超聲2s間歇4s共100次），4℃離心收集沉淀，用 buffer2（在 buffer1中加入2mol/L的尿素），4℃離心收集沉淀用 buffer3（20mmol/L Tris－HCl，0.5mol/LNaCl，7% 甘 油）洗 滌 沉 淀 兩 次，用buffer4（8mol/L 尿素，20mmol/L 磷酸二氫鈉，0.5mol/L NaCl）溶解沉淀。4℃ 離心收集上清，用 0.45μm 過(guò)濾。因?yàn)槟康牡鞍资菐?個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，進(jìn)而可按照Ni sepharose 6 Fast Flow使用說(shuō)明書(shū)的操作方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。分別用20mmol/L和40mmol/L咪唑洗滌跟柱子結(jié)合的雜蛋白，最后用300mmol/L咪唑洗下目的蛋白，并且收集樣品，對(duì)樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測(cè)分析組分的純度［6］。運(yùn)用透析的方法進(jìn)行復(fù)性，從5mol/L尿素逐步降低，分別配制透析液PBS含有10%甘油和5mol/L－0mol/L尿素，4℃攪拌分別10h，4℃離心收集上清進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效表達(dá)菌株的篩選

將重組質(zhì)粒pET32a－19肽分別轉(zhuǎn)化到不同型號(hào)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)，對(duì)其誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1，與對(duì)照組相比，大約在21ku處出現(xiàn)一條明顯的表達(dá)條帶，與推測(cè)的理論值大小相符，說(shuō)明目的基因在重組菌中得到了表達(dá)，后用軟件分析結(jié)果可知BL21（DE3）菌株表達(dá)量最高，大約18mg/L。

2.2 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化

如圖2，通過(guò)軟件分析可知當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)重組蛋白的表達(dá)量最高，pH為5.0時(shí)表達(dá)量最小，pH為7.5時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低，說(shuō)明重組菌在培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)適合表達(dá)目的蛋白，而過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)。

2.3 接種量的優(yōu)化

如圖3，通過(guò)軟件分析可知，接種量為3%時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，接種量繼續(xù)增加時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量開(kāi)始下降，而接種量為1%時(shí)表達(dá)量也很低。

2.4 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

圖1 高效表達(dá)菌株的篩選Fig.1 The screening of efficient recombinant bacteria

圖2 不同pH培養(yǎng)基對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Influence of pH on the expression of recombinant protein

圖3 不同接種量對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Influence of inoculation volume on the expression of recombinant protein

過(guò)低或過(guò)高的溫度都會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)與代謝。如圖4，在37℃時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高。

2.5 IPTG添加時(shí)間的優(yōu)化

誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)目的蛋白的表達(dá)有很大的影響，如圖5，OD600為0.7時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高。過(guò)早或過(guò)晚添加IPTG都會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)。

2.6 IPTG添加濃度的優(yōu)化

不同濃度的IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)有一定的影響，如圖6。在1.0mmol/L時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，隨著濃度增加目的蛋白的表達(dá)量開(kāi)始減少，因?yàn)楦邼舛鹊腎PTG會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒副作用。

圖4 不同溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Influence of induction temperature on the expression of recombinant protein

圖5 不同IPTG添加時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Influence of induced opportunity on the expression of recombinant protein

圖6 不同IPTG濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Influence of concentration of IPTG on the expression of recombinant protein

2.7 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)目的蛋白表達(dá)量有一定的影響，如圖7，軟件分析可知，誘導(dǎo)后3h到6h，目的蛋白的表達(dá)量逐漸上升，在誘導(dǎo)6h后表達(dá)量達(dá)到最高，之后由于菌體的衰老，合成能力開(kāi)始降低，甚至代謝產(chǎn)生出有害的產(chǎn)物，目的蛋白表達(dá)量逐漸下降。

2.8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用七因素三水平正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8，采用1D Gel Image Processing Software（Version 5.0.0.16 US）軟件分析，結(jié)果見(jiàn)表 2。根據(jù)極差分析由表3可知，在六個(gè)因素中因素F影響最大，C、E、A、B、D的影響依次減小。從正交結(jié)果中來(lái)看，A2B1C1D2E2F3表達(dá)量最高，可以達(dá)到54.57mg/L。根據(jù)極差和方差的影響大小選取的組合條件為A2B3C1D3E2F3，考慮IPTG具有一定的毒性和成本高，OD600的影響是最小的，所以選用A2B1C1D2E2F3作為最優(yōu)發(fā)酵條件。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Influence of induced time on the expression of recombinant protein

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal arrayfor fermentation condition

圖8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果SDS－PAGE電泳鑒定Fig.8 Identification of orthogonal experimental results by SDS－PAGE

2.9 融合蛋白可溶性分析

如圖9所示，重組蛋白主要存在于超聲后的沉淀中，因此主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。

2.10 融合蛋白的純化和復(fù)性

圖9 重組蛋白可溶性SDS－PAGE分析Fig.9 The analysis of recombinant soluble protein by SDS－PAGE

超聲破碎菌體，洗滌包涵體，再經(jīng)8mol/L尿素溶解，經(jīng)Ni sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，純化出的蛋白通過(guò)梯度透析方法進(jìn)行復(fù)性。SDSPAGE電泳顯示（圖10），純化出的融合抗腫瘤19肽純度很高，運(yùn)用軟件分析純度達(dá)到95%。目的蛋白復(fù)性可能造成一定量的損失，目的蛋白濃度降低，從圖11中可以看出復(fù)性后的蛋白沒(méi)有被降解或形成二聚體。

圖10 重組蛋白的純化Fig.10 Recombinant protein purification results by SDS－PAGE

圖11 重組蛋白的復(fù)性Fig.11 Recombinant protein purification refolding results by SDS－PAGE

3 結(jié)論與討論

為了獲得大量的重組蛋白，不僅要選擇理想的表達(dá)載體和宿主菌，還需要優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。不同型號(hào)的大腸桿菌促進(jìn)合成的代謝產(chǎn)物是有區(qū)別的，所以表達(dá)的目的蛋白含量也不相同，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同型號(hào)的大腸桿菌，才能找出最適合表達(dá)目的蛋白的工程菌株。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將重組質(zhì)粒pET32a－19肽分別轉(zhuǎn)化到不同型號(hào)的大腸桿菌中，篩選出高效表達(dá)菌株pET32a－19肽－BL21（DE3），在沒(méi)有優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件的情況下就可以達(dá)到18mg/L。BL21（DE3）是一種常規(guī)表達(dá)宿主菌，可以保護(hù)lon和ompT蛋白酶對(duì)目的蛋白酶的降解，而且是最常用的表達(dá)宿主菌。BL21（DE3）菌株不具有抗生素的抗性，可以節(jié)約成本。何莉，鮮盡紅等人用重組工程菌pET32a－CR1－SCR15－18/BL21（DE3）在高密度發(fā)酵中得到了，菌體產(chǎn)量為40g/L，CR1－SCR15－18蛋白表達(dá)率為28%［13］。因此，可以從高密度發(fā)酵來(lái)提高融合抗腫瘤19肽的表達(dá)量。

工藝研究不同pH的培養(yǎng)基會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)或菌體本身的酶促反應(yīng)，從而使重組蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)差異［7－8］。接種量過(guò)少時(shí)菌體繁殖緩慢，導(dǎo)致整個(gè)生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)，當(dāng)接種量過(guò)多時(shí)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快，對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)及溶氧的消耗加速，都不利于目的蛋白的表達(dá)。微生物在發(fā)酵過(guò)程中伴隨著很多酶促反應(yīng)，來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成，所以溫度對(duì)于發(fā)酵是很重要的因素。過(guò)早添加IPTG會(huì)影響細(xì)菌的增殖，菌體的量相對(duì)較少，導(dǎo)致蛋白的表達(dá)量低;過(guò)晚添加IPTG，菌體處于穩(wěn)定期或后期，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣量降低，并且代謝速度減慢，合成物質(zhì)的能力降低，蛋白的表達(dá)量降低［9－10］。IPTG具有毒性，而且價(jià)格比較高，過(guò)高會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)代謝，過(guò)少會(huì)對(duì)菌體的誘導(dǎo)力度不夠，從而影響目的蛋白的表達(dá)，所以要選擇合適的IPTG添加濃度［11－12］。通過(guò)對(duì)工程菌株在接種量、培養(yǎng)基的 pH、溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG添加時(shí)間六個(gè)影響因素上進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選出最適合工程菌株的發(fā)酵條件為培養(yǎng)基的pH為7.0、接種量為3%、IPTG 濃度 0.1mmol/L、IPTG 添加時(shí)間 OD600為 0.7、誘導(dǎo)溫度為41℃和誘導(dǎo)時(shí)間5h，通過(guò)軟件分析重組目的蛋白的表達(dá)量高達(dá)54.57mg/L。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)重組蛋白的量是有限的，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行高密度發(fā)酵。

原核誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，形成的包涵體可以減少蛋白酶對(duì)其降解和提高表達(dá)產(chǎn)量，通過(guò)對(duì)其包涵體進(jìn)行不同方式的洗滌，更利于分離目的蛋白。在洗滌包涵體的過(guò)程中加入了2mol/L的尿素、1%TritonX－100和EDTA洗去可溶的粘附的細(xì)菌蛋白，通過(guò)不同溶液洗滌，得到了較高純度的包涵體，有利于之后的蛋白純化。pET32a質(zhì)粒帶有組氨酸標(biāo)簽，可以運(yùn)用親和層析的方法純化目的蛋白，方便簡(jiǎn)單。因此pET32a－19肽－BL21（BE3）表達(dá)的融合蛋白可以通過(guò)Ni sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，得到目的蛋白，運(yùn)用軟件分析純度達(dá)到95%。透析對(duì)于蛋白復(fù)性來(lái)說(shuō)是比較穩(wěn)定和有效的方法，但其缺點(diǎn)是需要大量的透析液。運(yùn)用梯度透析的方法，復(fù)性了純化出的目的蛋白，但在復(fù)性過(guò)程中出現(xiàn)了少量的沉淀，可能是蛋白復(fù)性過(guò)程中錯(cuò)誤折疊，使復(fù)性出的蛋白減少，有部分蛋白被復(fù)性成功。為以后的抗腫瘤融合19肽的活性實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］王淑靜，張藝，劉佳，等.腫瘤抑素抗腫瘤活性肽的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21（1）:56－59.

［2］Maeshima Y，Manfredi M，Reimer C，et al.Identification of the anti－angiogenic site with in vas cular basement membrane derived tumstatin［J］.J Biol Chem，2001，276（18）:15240－15248.

［3］FloquetN，Pasco S，RamontL，etal.The antitumor propertiesof the α3（IV）－ （185 － 203）peptide from the NC1 domain of type IV collagen（tumstatin）are conformationdependent［J］.J Biol Chem，2004，279（3）:2091－2100.

［4］Folkman J.Tumor suppression by p53 is mediated in part by the antiangiogenic activity of endostatin and tumstatin［J］.Sci STKE，2006，2006:pe35

［5］Y Hamano，R Kalluri.Tumstatin the NC1 domain of a3 chain of type IV collagen，is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth，Biochem［J］.Biophys Res Commun，2005，333（2）:292－298.

［6］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.第3版.北京:科學(xué)出版社，2002:1256－1259.

［7］沈?qū)毭?，譚新球，譚周進(jìn)，等.影響工程菌株目的基因表達(dá)的因素［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010（3）:6－12.

［8］關(guān)瑜，陳歡，李旭媛，等.類(lèi)人膠原蛋白表達(dá)的優(yōu)化與純化的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（14）:217－220.

［9］戎晶晶，刁振宇，周?chē)?guó)華.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12（6）:416－420.

［10］黎名元，郭新民，喬傳令.重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26（6）:55.

［11］楊煒，王偉剛，田海英，等.重組大腸桿菌高表達(dá)高密度發(fā)酵研究［J］.生物技術(shù)，2006，16（3）:83－86.

［12］任增亮，堵國(guó)成，陳堅(jiān)，等.大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白策略［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，27（9）:103.

［13］何莉，鮮盡紅，劉高科，等.重組工程菌 pET32a－CR1－SCR15－18/BL21（DE3）高密度發(fā)酵工藝研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)，2011，33（9）:896－899.