陳紅英，徐建蓉，劉文靜，李學(xué)剛

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西南綿陽 621010；2.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716）

目前，國內(nèi)外學(xué)者均在積極地尋找具有清除自由基功能的有效藥物，抗氧化活性研究也成為研究和評價現(xiàn)代食品開發(fā)的重要內(nèi)容之一。黃連是常見中藥之一，為毛莨科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的干燥根莖，具有清熱燥濕、泄火解毒、抑菌、抗氧化等多種功效[1]。它的主要化學(xué)成分是小檗堿、黃連堿、表小檗堿、藥根堿和巴馬汀等幾種生物堿，其中小檗堿的含量最高，約為10%[2]。近研究表明黃連的很多活性如抗炎、降糖、抗癌等與其抗氧化作用有關(guān)[3-4]，其中五種主要生物堿具有不同程度清除自由基的活性，特別是小檗堿[5-6]。但事實(shí)上，黃連大多以煎劑或粉劑形式在臨床上使用，五種生物堿總量約占其中30%，而余下組分的作用則鮮有報道。為充分開發(fā)利用黃連藥材，所在課題組對黃連各組分的抗氧化作用進(jìn)行了研究，以期為黃連各部分資源的效利用和黃連藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃連藥材 來源于重慶石柱黃連GMP生產(chǎn)基地，由重慶西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛教授鑒定，標(biāo)本存放于西南大學(xué)藥學(xué)院黃連研究中心；色譜甲醇、色譜乙腈、其余試劑 均為分析純。

TBP-300B高速逆流色譜儀 上海同田生化公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Hypersil BDS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm） 大連依利特科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì) 上海UNICO公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各組分的制備與含量測定 按照下列圖示分別制備各組分，并測定各組分的含量。

圖1 黃連組分分離流程圖Fig.1 Separation schematic of constituents from Coptis chinensis Franch

1.2.1.1 多糖制備與含量測定 參照方法[7]，稱取粉碎至20目的黃連粗粉置于索氏提取器中，用5倍量無水乙醇回流脫脂6h。濾渣揮干后，加入10倍水，80℃水浴回流提取1h。提取液調(diào)pH至中性，抽濾，濾液減壓濃縮至100mL。按照除蛋白、醇沉等步驟提取粗多糖。真空干燥后即得灰白色粉末狀的黃連粗多糖。多糖含量按照文獻(xiàn)[8]，用苯酚-硫酸法測定。以葡萄糖為對照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 高速逆流色譜制備總堿及親水性組分 多糖提取后余液濃縮至干得浸膏，參照文獻(xiàn)[9]，選定溶劑體系為：0～300min，氯仿∶甲醇∶0.2mol/L HCl（4∶1.5∶2，v/v））；300min以后，氯仿∶甲醇∶0.2mol/L HCl（4∶2∶2，v/v）。上相為固定相，下相為流動相。稱取浸膏300mg，用流動相配成20mL的樣品溶液。將固定相以20mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的分離柱中；開啟恒溫冷卻泵，溫度為25℃；打開主機(jī)，泵入流動相，設(shè)置轉(zhuǎn)速800r/min，流速2mL/min，波長254nm；待兩相體系平衡好后，把樣品溶液吸入分離柱中。

根據(jù)色譜工作站譜圖收集餾分。按峰收集1～5號峰，合并濃縮至干得總堿。固定相中溶液用氮?dú)獯党鰸饪s至干得親水性組分。HPLC分析按照藥典2010版黃連定量分析方法進(jìn)行，流動相：乙腈-50mmol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，其中含15mmol/L十二烷基磺酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：254nm。

1.2.1.3 多酚含量測定 精密稱取黃連浸膏及親水性組分50mg，用水配制成1mg/mL的溶液，取0.5mL用水定容至50mL。按照文獻(xiàn)[10]用福林酚法測定多酚含量。以沒食子酸為對照品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 抗氧化活性測試

1.2.2.1 線粒體ROS法 取新鮮兔腎臟按照方法[11]提取線粒體并保存。線粒體用顯微鏡觀察，應(yīng)為藍(lán)綠色圓形顆粒。取已制備的兔肝線粒體懸液，按照文獻(xiàn)方法[10]測定活性氧。先加入pH7.2的緩沖液，然后加入兩種復(fù)合體I和II底物：谷氨酸鹽40mmol/L與琥珀酸鹽40mmol/L，最后加入探針51mmol/L DCFH-DA，終濃度為5μmol/L。反應(yīng)總體積為400μL。VC作為陽性對照。藥物組設(shè)置高中低三個劑量，每個劑量三個重復(fù)且設(shè)置背景對照。加樣體積見下表，加樣順序?yàn)椋壕彌_液-底物-探針-線粒體。避光混合均勻后立即于熒光酶標(biāo)儀下測定30min內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長531nm）。熒光強(qiáng)度與時間的關(guān)系用線性回歸擬合處理，計(jì)算直線斜率。按以下公式計(jì)

其中：A0為空白對照液的吸光度，AX為加入待測溶液后的吸光度，AX0為待測溶液的空白吸收值。

1.2.2.3 O2-·的清除能力實(shí)驗(yàn) 采用鄰苯三酚自氧化法[13]。在試管中加入50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）2.8mL，0.1mL不同濃度的樣品溶液，于25℃保溫10min，然后加入0.1mL 25℃的60mmol/L的鄰苯三酚0.1mL，總體積3.0mL，迅速搖勻，在420nm處測定其吸光度值，每隔0.5min記錄一次。以0.1mL 10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液作為待測溶液的空白吸收值。每個濃度測定三次，結(jié)果取其平均值。VC作為陽性對照。對O2－·的清除率可表示為：算抑制率。

抑制率（%）=[空白熒光斜率-（樣品熒光斜率-樣品背景熒光斜率）]/空白熒光斜率×100

1.2.2.2 DPPH·清除率 按照方法[12]，分別取三種不同濃度的各樣品溶液1.0mL，于試管中，加入3.0mL的DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)30min，同時以無水乙醇為空白，于517nm波長處測定吸光值。按下列公式計(jì)算樣品對DPPH自由基清除率。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，求得清除率的平均值。VC作為陽性對照。

其中：△A0為未加待測溶液時鄰苯三酚自氧化速率；△A為加入待測溶液后的鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.2.4 ·OH清除實(shí)驗(yàn) 采用水楊酸法[12]。在試管中加入9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇1mL和待測溶液1mL，最后加入8.8mmol/L H2O21mL。37℃反應(yīng)0.5h后，12000r/min離心6min，然后以雙蒸水作參比，在510nm下測定吸光度。以9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸-乙醇1mL，待測溶液1mL和雙蒸水1mL作為待測溶液的本底吸收值。每一吸光值平行測3次，取其平均值。VC作為陽性對照。清除率計(jì)算公式同1.2.2.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 組分制備結(jié)果分析

按照方法1.2.1.3，取黃連45g，采用水提取醇沉法，得到灰白色塊狀的黃連粗多糖0.6305g。余液濃縮至干后，按照分離流程圖得到其余各組分。

HSCCC利用物質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)分離，對樣品損失少，且不會引起組分變性。樣品在固定相（水相）與流動相（氯仿相）中不斷往復(fù)萃取，按照組分在兩相中分配系數(shù)的差異先后流出，據(jù)相似相溶原則，易隨流動相流出的為易溶于有機(jī)溶劑的弱極性組分，最后為易溶于水相的親水性組分。

圖2 HSCCC餾分在黃連浸膏HPLC圖譜上的分布圖Fig.2 Schematic of HSCCC fractions from Coptis chinensis Franch extracts in HPLC

餾分在HPLC圖上的分布見圖2，可見經(jīng)高速逆流色譜分離后，黃連浸膏分離后基本分成兩大塊：總生物堿部分、親水性組分（在氯仿-甲醇-水體系中更易溶解于水相）。其中總生物堿組分包括了五種主要生物堿，這部分是往往是大家關(guān)注的重點(diǎn)。而其余餾分則鮮有相關(guān)研究報道。餾分經(jīng)減壓濃縮至干，總生物堿組分占浸膏61.6%，而親水性的組分占37.2%，其余為加樣后隨即被流動相帶出的極弱性組分（因得到的量較少未做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)）。徐穎[14]曾用80%乙醇回流提取得浸膏，并結(jié)合離子對萃取，紫外分光光度法測得浸膏中總生物堿含量為31.49%±1.41%。此實(shí)驗(yàn)中采用提取多糖后的水提取液濃縮后浸膏直接進(jìn)行逆流色譜分離，在線監(jiān)測，按峰收集并HPLC跟蹤，最終得到總生物堿組分和親水性組分，此數(shù)據(jù)與我們前期實(shí)驗(yàn)用黃連粗粉用溶劑體系直接溶解后進(jìn)樣得到的結(jié)果非常相似。

2.2 多酚與多糖含量測定結(jié)果與分析

普遍認(rèn)為，中藥材的抗氧化活性與多酚含量有關(guān)[15-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)用福林酚法測定了浸膏和親水組分中多酚的含量。用沒食子酸為對照，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0998x+0.0426，R2=0.9992，線性范圍為0～0.4g/L。以100g樣品中沒食子酸當(dāng)量表示，黃連浸膏中多酚含量為1.65g/100g，親水性組分中多酚含量相當(dāng)于沒食子酸當(dāng)量為（35.2±2.28）g/100g。醇提浸膏中多酚含量與文獻(xiàn)[17]一致，親水組分中多酚含量較高估計(jì)與其含有阿魏酸、綠原酸、木蘭堿等酚酸組分有關(guān)。

按照方法1.2.1.3，用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對照，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0074x+0.0016，R2=0.9976，線性范圍為：10～135μg/mL。黃連中多糖含量為0.3586%，粗多糖中多糖含量為39.47%。與文獻(xiàn)[18]結(jié)果測得黃連藥材中多糖含量為0.32%～0.81%，粗多糖中含量約30.96%～55.45%基本一致，只是文獻(xiàn)采用堿提取，木瓜酶與Sevag法結(jié)合除蛋白，粗多糖的純度較高。

2.3 抗氧化活性結(jié)果與分析

活性氧（ROS）有酶源性、非酶源性、線粒體性等多種來源，其中線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS的主要途徑，包括有O2-·、·OH、H2O2等許多種類。O2-·是機(jī)體內(nèi)壽命最長的自由基，通常是自由基反應(yīng)的引發(fā)劑；·OH是體內(nèi)最活潑的活性自由基。實(shí)驗(yàn)用不同的評價體系對黃連各組分的抗氧化活性進(jìn)行了測試，結(jié)果見表1。維生素C的活性與相關(guān)文獻(xiàn)[19，10]基本上一致并作對照。

線粒體ROS法和DPPH法主要體現(xiàn)總抗氧化能力，從表1中可看出兩法測定結(jié)果大體趨勢一致，浸膏的總抗氧化能力最強(qiáng)，而親水性組分略低于總堿的活性，多糖的抗氧化活性相對較弱，但也呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗氧化活性，這似乎與黃連在臨床上多用粗粉或水提液藥用一致。親水性組分的抗氧化活性估計(jì)與其含有較高含量的多酚物質(zhì)比如阿魏酸、木蘭堿、綠原酸等有關(guān)。因此也說明黃連中某些成分含量雖少，但與其他成分并存時，卻可能存在協(xié)同增效的作用。

表1 各化合物抗氧化活性結(jié)果Table 1 Antioxidant activity of compounds

從對兩種自由基的清除作用來看，總堿的優(yōu)勢較明顯，均強(qiáng)于親水性組分，特別是對O2－·的清除作用明顯優(yōu)于其他組分，IC50為85mg/mL，說明幾種主要生物堿對O2－·的清除作用顯著。從對·OH的清除作用比較，浸膏的效果占優(yōu)，甚至優(yōu)于總堿，親水性組分也表現(xiàn)出較明顯的作用，這與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，說明對·OH產(chǎn)生清除作用的多為一些親水性成分。楊澄等[18]也認(rèn)為黃連炮制后，清除·OH的能力顯著降低，水提物的清除能力明顯優(yōu)于醇提物，而與之相反，對O2－·的清除作用卻是醇提物清除活性強(qiáng)于水提物，可能原因是醇提物中生物堿等小分子含量高于水提物，減少了蛋白質(zhì)、多糖等溶出的原因。多糖對兩種自由基均呈現(xiàn)一定的清除效果。

3 結(jié)論

用HSCCC可一次性無損失的完全分離黃連中的主要生物堿，并按分配系數(shù)差異進(jìn)行組分分離；黃連的抗氧化活性成分并非只有幾種主要生物堿，其清除超氧自由基O2－·及清除·OH能力是黃連生物堿及其他組分合力而為。黃連抗氧化作用機(jī)制較多，要闡明其抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)需要建立合適的活性評價體系，并進(jìn)一步加大分離提取工作。

[1]李彩虹，周克元.黃連活性成分的作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（2）：466-468

[2]匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003.

[3]Jung H A，Min B S，Yokozawa T，et al.Anti-Alzheimer and antioxidant activities of Coptidis Rhizoma alkaloids[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin，2009，32（8）：1433-1438.

[4]Liu F，Ng T B.Antioxidative and free radical scavenging activities of selected medicinal herbs[J].Life Sciences，2000，66（8）：725-735.

[5]Jang M H，Kim H Y，Kang K S，et al.Hydroxyl radical scavenging activities of isoquinoline alkaloids isolated fromCoptis chinensis[J].Archives of Pharmacal Research，2009，32（3）：341-345.

[6]Jung H A，Yoon N Y，Bae H J，et al.Inhibitory activities of the alkaloids from Coptidis Rhizoma against aldose reductase[J].Archives of Pharmacal Research，2008，31（11）：1405-1412.

[7]姜延偉，王懿萍，吳玉娟，等.黃連多糖抑菌活性初探[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：48-49.

[8]黃東萍，文東旭，林文翰.天芎注射液中多糖的含量測定[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20（2）：167-168.

[9]Chen H Y，Ye X L，Cui X L，et al.Cytotoxicity and antihyperglycemic effect of minor constituents from Rhizoma Coptis in HepG2 cells[J].Fitoterapia，2012，83（1）：67-73.

[10]張國友，唐玲，陳瑋，等.分光光度法測定蒙古櫟葉中多酚的含量[J].中國科學(xué)院研究生院學(xué)報，2009，26（3）：319-322.

[11]He K，Li X，Ye X，et al.A mitochondria-based method for the determination of antioxidant activities using 2′，7′dichlorofluorescin diacetate oxidation[J].Food Research International，2012，48（2）：454-461.

[12]陳雯，唐生安，秦楠，等.牛尾菜抗氧化活性成分研究[J].中國中藥雜志，2012，37（6）：806.

[13]陳美珍，宋彩霞，陳偉洲，等.海蘆筍提取物體外抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2009，30（20）：71-74.

[14]徐穎.黃連總生物堿的提取及其對實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的初步研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2006.

[15]Wojdy?o A，Oszmiański J，Czemerys R.Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs[J].Food Chemistry，2007，105（3）：940-949.

[16]Li H B，Wong C C，Cheng K W，et al.Antioxidant propertiesin vitroand total phenolic contents in methanol extracts from medicinal plants[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（3）：385-390.

[17]Cai Y，Luo Q，Sun M，et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences，2004，74（17）：2157-2184.

[18]吳玉娟，王懿萍，姜延偉，等.黃連多糖含量測定及抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：1906-1908.

[19]向志軍，趙廣榮，元英進(jìn)，等.復(fù)方丹參的體外抗氧化活性研究[J].中草藥，2006，37（2）：211-213.

[20]楊澄，仇熙.黃連炮制品清除氧自由基和抗指質(zhì)過氧化作用[J].南京大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，37（5）：659-663.