農(nóng)鳳映，陳華梅，何家欣，石妹飛，李韜

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科3班，廣西 百色 533000 E－mail：976468567＠qq.com；2.右江民族醫(yī)學(xué)院2011級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科2班，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學(xué)院2012級(jí)管理專業(yè)，廣西 百色 533000；5.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

肝細(xì)胞作為肝臟中主要的實(shí)質(zhì)性和功能性細(xì)胞，對(duì)化學(xué)物質(zhì)、藥物、免疫性疾病、酒精等損傷因素非常敏感，肝細(xì)胞損傷程度可表現(xiàn)為肝組織壞死、肝脂肪化、肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌［1］。肝損傷的治療原則為維護(hù)肝細(xì)胞功能的穩(wěn)定性，減少肝細(xì)胞組織炎癥的程度，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)等。三七是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，自古有“增強(qiáng)免疫神藥”的美稱，由于三七具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、擴(kuò)充血管、抗炎、抗纖維化、抗衰老等藥理作用，本實(shí)驗(yàn)采用卡介苗（BCG）加脂多糖（LPS）聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠，制造慢性免疫性肝損傷模型，觀察三七粉對(duì)慢性免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①試劑及儀器：脂多糖（sigma公司產(chǎn)品，T0056 BR＞97%），卡介苗（成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，凍干粉狀，0.25毫克／支，1mg含1.0×106CFU），三七粉（云南向輝生物科技有限公司）。恒溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），高倍光學(xué)顯微鏡（德國卡爾蔡公司）。②動(dòng)物：昆明種小鼠，雌性，體重20～25g，45只，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供，CL級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)：syxk桂2011－0010。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥 將小鼠隨機(jī)分為三組，即正常組、模型組、三七粉治療組，每組15只，除正常組外，按參考文獻(xiàn)［2］修改，給予尾靜脈注射（iv）BCG 0.2ml（2.5毫克／只，約含5×107個(gè)活菌數(shù)），第10d尾靜脈注射LPS 0.1ml（10微克／只），每隔10d交替用BCG和LPS致敏1次；第1次致敏后治療組給三七粉1.35g／kg灌胃，每天1次，直至第50d實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 檢測(cè) 處死小鼠取肝臟、脾臟和胸腺并計(jì)算臟器指數(shù)。取肝、脾、胸腺組織，制成勻漿，HE染色涂片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組織細(xì)胞形態(tài)變化。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）×100%

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，各組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三七粉對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組和三七粉治療組小鼠肝、脾指數(shù)顯著高于正常組（P＜0.05或P＜0.01），胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但三七粉治療組與模型組比，肝、胸腺指數(shù)下降不明顯（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 三七粉對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 （）

表1 三七粉對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 （）

注：與正常組比較，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

2.2 三七粉對(duì)小鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響 正常組肝細(xì)胞輪廓清晰，肝細(xì)胞圓潤大小正常，胞質(zhì)豐富無腫脹，且染色深；模型組肝細(xì)胞呈較大范圍的嗜酸性壞死，肝細(xì)胞腫脹較明顯，胞質(zhì)染色變淡，細(xì)胞膜與胞質(zhì)分界明顯，且細(xì)胞周圍有不同程度的組織壞死；三七粉治療組肝細(xì)胞輕度腫脹，胞質(zhì)染色較模型組深，肝細(xì)胞壞死程度輕，結(jié)果見圖1。

圖1 三七粉對(duì)小鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響（×400）A：正常組 B：模型組 C：三七粉治療組

2.3 三七粉對(duì)小鼠脾組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響 正常組脾細(xì)胞染色深，細(xì)胞輪廓大致清晰，細(xì)胞大小正常，胞質(zhì)豐富，染色深；模型組肝細(xì)胞大小相差較大，細(xì)胞輪廓模糊，部分細(xì)胞輕度腫脹，胞質(zhì)染色變淡；三七粉組脾細(xì)胞腫脹程度輕，胞質(zhì)染色較深，細(xì)胞壞死程度輕，結(jié)果見圖2。

圖2 三七粉對(duì)小鼠脾組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響（×400）A：正常組 B：模型組 C：三七粉治療組

2.4 三七粉對(duì)小鼠胸腺組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響 正常組胸腺細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)染色深，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞大小正常；模型組胸腺細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞腫脹較大，胞膜表面不平；三七粉治療組胸腺細(xì)胞腫脹程度輕，胞質(zhì)染色較深，壞死程度輕，結(jié)果見圖3。

3 討論

圖3 三七粉對(duì)小鼠脾組織細(xì)胞形態(tài)變化的影響（×400）A：正常組 B：模型組 C：三七粉治療組

肝損傷過程大多與氧化應(yīng)激和免疫有關(guān)，化學(xué)物質(zhì)、藥物、酒精等能直接或間接誘導(dǎo)肝細(xì)胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，活化細(xì)胞死亡程序等，采用BCG加LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫性肝損傷是公認(rèn)的較理想的造模方法［3］，BCG可使多核中粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞聚集于肝，繼后再用低劑量LPS攻擊注射，可激發(fā)這些細(xì)胞釋放對(duì)肝細(xì)胞有毒性作用的多種免疫效應(yīng)分子，如氧自由基、細(xì)胞因子等，引發(fā)免疫性肝損傷［4］。本實(shí)驗(yàn)采用BCG＋LPS聯(lián)合多次誘導(dǎo)慢性免疫性肝損傷，同時(shí)給予三七粉治療，觀察三七粉對(duì)免疫性肝損傷有否保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BCG加LPS聯(lián)合多次誘導(dǎo)，可造成小鼠肝、脾、胸腺器官不同程度的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞腫大，輪廓模糊不清，胞膜不平，有壞死等。而用三七粉干預(yù)治療后其肝、脾、胸腺細(xì)胞腫大不明顯，胞質(zhì)著色較接近正常組，細(xì)胞壞死程度較輕。臟器指數(shù)觀察，模型組和三七粉治療組小鼠肝、脾指數(shù)顯著高于正常組（P＜0.05或P＜0.01），但三七粉治療組比模型組有所下降，說明免疫性損傷對(duì)肝、脾臟器都有損害，用三七粉治療后損傷程度有所降低。

實(shí)驗(yàn)表明三七粉對(duì)慢性免疫性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與三七粉具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化功能有關(guān)。

［1]毛穎婕，徐彭，劉清華，等.肝損傷的中藥治療研究進(jìn)展［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（1）：91－94.

［2]茄仁萍，吳錫銘，朱幸芳.小鼠慢性免疫性肝損傷模型建立與篩選［J］.醫(yī)學(xué)研究通訊，2012，32（12）：31－33

［3]黃凱，楊新波，陳紅艷，等.兩種急性免疫性肝損傷小鼠模型的對(duì)比研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（11）：31－34.

［4]鄧家剛，鄭作文，王勤，等.復(fù)方黃根對(duì)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13（5）：37－38.