武 月 紅，解 玉 梅

(1.包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030;2.總裝備部裝備指揮技術(shù)學(xué)院士官學(xué)校門診部，北京 102249)

近幾年來，國內(nèi)外許多學(xué)者調(diào)查和研究了一些植物提取物的抗菌、殺菌活性。張應(yīng)烙等［1］通過井岡山47種植物丙酮提取物對幾種病原菌的抑菌生物活性測定，發(fā)現(xiàn)山雞椒、凹葉厚樸和深山含笑提取物中含有農(nóng)用抗菌成分，且抑菌譜較廣，作為植物源殺菌劑值得進(jìn)一步研究。西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心對西北地區(qū)200余種植物的殺菌活性進(jìn)行了初步篩選，綜合分析認(rèn)為，菊科和豆科植物在植物源殺菌劑的研究中值得重視［2］。喻大昭等以黃瓜灰霉病菌為供試菌，對49種植物粗提物進(jìn)行了生物活性篩選，結(jié)果表明，油茶和辣蓼粗提物的抑菌活性較高，有必要進(jìn)一步對其不同組分進(jìn)行分離、純化、活性追蹤，最終確定其主要活性組分［3］。陳嬌等通過58種植物提取液對葡萄霜霉病菌的游動孢子囊萌發(fā)抑制率和接種葉圓盤的發(fā)病控制研究，篩選出虎耳草，黃檀，馬尾松，牡丹，刺槐5種具有抑菌作用的植物提取液［4］。孫海峰等以龍膽斑枯病菌為供試菌種，對9種中藥乙醇提取物進(jìn)行抗龍膽斑枯菌活性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種中藥乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子、知母14d最低抑菌質(zhì)量濃度小于0.1g/ml，具有較強(qiáng)的抗龍膽斑枯病菌作用［5］。此外，傘形科、衛(wèi)矛科、葫蘆科、桑科等植物的抗菌、殺菌活性均有過報道［6］。

為本實驗選取的五種松科植物屬于北方地區(qū)常見的園林綠化樹種，具有來源廣泛、取材方便的優(yōu)勢。通過其乙醇提取物對幾種常見的引起植物細(xì)菌和真菌病害的致病菌的抑菌效果探究，為篩選和開發(fā)新型植物源殺菌劑提供思路;對提高松科植物的經(jīng)濟(jì)價值，擴(kuò)大其使用范圍具有重要意義。

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 供試植物

油松(Pinus tabulaeformis)、樟子松(Pinus sylvestris L.var.mongholica Litv)、白皮松(Pinus bungeana Zucc.ex Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白杄(Picea meyeri Rehd.et Wils)(以上植物均采自內(nèi)蒙古包頭市阿爾丁植物園)

1.2 供試菌種

三種細(xì)菌性病害大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和三種真菌病害青霉菌(Penicillium)、葡萄灰霉菌(Botrytis cinerea)和黃曲霉(Aspergillus flavus)(包頭師范學(xué)院微生物實驗室提供)

1.3 化學(xué)試劑

牛肉 膏、蛋 白 胨、NaCl、瓊 脂 粉、NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4.7H2O 、FeSO4、蔗糖、乙醇、甘油、蒸餾水、無菌水、雙蒸水

1.4 主要實驗設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、索氏提取器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子分析天平、冰箱、顯微鏡、微波爐、打孔器、過濾器(含無菌濾膜)、剪刀、移液槍、Peteroff－h(huán)auser記菌器、血球計數(shù)板、涂布器、接種環(huán)、鑷子、試管、離心管(1.5ml)、濾紙、剪刀、封口膜、玻璃棒、三角瓶、燒杯、培養(yǎng)皿 、酒精燈等。

2 實驗方法

2.1 菌種的活化

在超凈工作臺上分次以無菌操作將供試細(xì)菌從試管斜面以劃線法轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨管斜面固體培養(yǎng)基、將供試真菌轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基試管斜面和培養(yǎng)皿平板，每種細(xì)菌各接5管左右備用，每種真菌分別接5管斜面和5個平板，操作中注意嚴(yán)格無菌操作，同時要試做好相應(yīng)的記號避免菌種混亂。細(xì)菌轉(zhuǎn)接好以后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24－48小時使菌體達(dá)到最壯生長狀態(tài)冰箱冷藏備用、真菌轉(zhuǎn)接好以后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，試管種待菌絲體成熟長出孢子為宜，平板種待菌絲體鋪滿平板即可使用，不用時冰箱冷藏。

2.2 樣品提取液的制備

在植物園內(nèi)分別采取新鮮完好的油松(Pinus tabulaeformis)、樟子松(Pinus sylvestris L.var.mongholica Litv)、白皮松(Pinus bungeana Zucc.ex Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白杄(Picea meyeri Rehd.et Wils)的葉片，參考晏衛(wèi)紅等方法［3］，無菌操作，75%酒精消毒60s，0.005%高錳酸鉀溶液消毒30s，再用無菌水沖洗3次，自然烘干，得到樣品材料。

2.2.1 油松提取液的制備

將準(zhǔn)備好的油松葉片用無菌剪刀剪碎，并準(zhǔn)確稱取100g，用無菌濾紙將其裹好并放入索氏抽提管內(nèi)，用95%的乙醇回流抽提2小時。如此反復(fù)共提取500g整株植物，將5次提取液收集合并，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，稱干物質(zhì)5g用5ml無菌蒸餾水完全溶解即為1g/ml的樣品提取液，將原液通過無菌濾膜過濾以除去雜菌。實驗時還需要用無菌蒸餾水取一定量原液配成0.9g/ml、0.8g/ml、0.7g/ml、0.6g/ml、0.5g/ml、0.4g/ml、0.3g/ml的稀釋液，加原液一共8個濃度梯度，放無菌離心管標(biāo)識清楚，冰箱冷藏備用。

2.2.2 其它部位植物提取液的制備

將準(zhǔn)備好的樟子松、白皮松、青杄、白杄，同上述油松的提取液的制備方法一樣，分別制備好整株植物提取1g/ml的原液，通過無菌濾膜過濾以除去雜菌，實驗時用無菌蒸餾水配成 0.9g/ml、0.8g/ml、0.7g/ml、0.6g/ml、0.5g/ml、0.4g/ml、0.3g/ml的稀釋液，放無菌離心管標(biāo)識清楚，冰箱冷藏備用。

2.3 抑菌活性的測定

2.3.1 細(xì)菌和真菌菌懸液的制備

細(xì)菌菌懸液的制備:分別選取經(jīng)過24－48小時培養(yǎng)后菌體生長狀態(tài)最為旺盛的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1－2管，在超凈工作臺上無菌操作，注意做好標(biāo)記。

以大腸桿菌為例:先往大腸桿菌試管斜面中倒入2ml左右無菌水，用灼燒滅菌的接種環(huán)輕輕刮動斜面的菌種，反復(fù)震蕩，直接得到較濃的菌懸液，在顯微鏡下以Peteroff－h(huán)auser記菌器計數(shù)菌體個數(shù)，經(jīng)過稀釋，調(diào)至濃度為含細(xì)菌菌體106—108個/ml的大腸桿菌菌懸液，冰箱冷藏備用。

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌懸液制備方法相同。

真菌菌懸液的制備方法基本相同，計數(shù)用血球計數(shù)板在顯微鏡下數(shù)孢子數(shù)約為108個/ml即可。

2.3.2 濾紙片的浸泡

用打孔器取直徑7mm的濾紙片，滅菌后將濾紙片分別放入五種松科植物提取物的各個稀釋梯度提取液及對照無菌水中浸泡2h，待用。

2.3.3 對比相同濃度下五種松科植物提取物對三種供試細(xì)菌的抑菌活性

在超凈工作臺中嚴(yán)格按照無菌操作要求，把提前配制好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化后倒入直徑為90mm的平皿，冷卻凝固后用移液槍分別吸取三種供試細(xì)菌的菌懸液0.2ml，分散滴到平皿上，以滅菌的涂布器涂布均勻，使菌懸液滲入到培養(yǎng)基中。用無菌鑷子分別夾取相同濃度下浸泡五種松科植物提取液并基本瀝干的濾紙片(無菌水浸泡的濾紙片為空白對照)等距放在同一個平皿內(nèi)，對比相同濃度下五種松科植物提取物對三種供試細(xì)菌的抑菌活性。共做八個濃度梯度，每個梯度做三組重復(fù)。置恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑大小，取其平均值作為實驗結(jié)果。并將實驗結(jié)果記錄。

2.3.4 對比相同濃度下五種松科植物提取物對三種供試真菌的抑菌活性

方法基本同上，只是用無菌鑷子分別夾取相同濃度下浸泡五種松科植物提取液并基本瀝干的濾紙片(無菌水浸泡的濾紙片為空白對照)等距放入已經(jīng)培養(yǎng)好并且活化成功的真菌平板上(菌絲體密布平板)，對比相同濃度下五種松科植物提取物對三種供試真菌的抑菌活性。共做八個濃度梯度，每個梯度做三組重復(fù)。置恒溫培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)48h后，測量抑菌圈直徑大小，取其平均值作為實驗結(jié)果。并將實驗結(jié)果記錄。

圖1:五種松科植物乙醇提取物對大腸桿菌菌的抑菌效果比較

圖2:五種松科植物乙醇提取物對金黃色葡萄球菌菌的抑菌效果比較

2.4 最小抑制濃度(MIC)的測定

用液體懸浮培養(yǎng)法測定五種松科植物提取物的對三種供試細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)，具體操作過程如下:

取滅菌試管8管，用記號筆標(biāo)注好，分別用移液槍加入過濾除菌的五種松科植物提取物(濃度為1g/ml)6.5ml、6.0ml、5.5ml、5.0ml、4.5ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml，然后分別加入滅菌并冷卻至 40℃以下的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基定容至10ml。分別接入不同供試細(xì)菌懸液0.2ml，混勻。以無菌蒸餾水做空白對照，37℃下震蕩培養(yǎng)，每隔2小時觀察一次，視培養(yǎng)液變渾濁為長出細(xì)菌，而培養(yǎng)液澄清為無細(xì)菌長出。以供試菌能抑制生長的最低添加量為該提取物的最低抑菌濃度(MIC)，分別將結(jié)果記錄于表1中。

3 結(jié)果與分析

3.1 相同濃度下五種松科植物乙醇提取物對三種供試細(xì)菌的抑菌活性比較

圖3:五種松科植物乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果比較

圖4:五種松科植物乙醇提取物對青霉菌的抑菌效果比較

圖5:五種松科植物乙醇提取物對葡萄灰霉菌的抑菌效果比較

圖6:五種松科植物乙醇提取物對黃曲霉的抑菌效果比較

通過以上6幅圖可以看出，五種松科植物乙醇提取物對三種被測試細(xì)菌和三種被測試真菌在一定濃度下都表現(xiàn)出了抑菌作用，且在相同濃度下對細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)于真菌。就三種供試細(xì)菌而言，在相同濃度下，不同種植物提取物對供試細(xì)菌的抑菌作用表現(xiàn)為:油松提取物＞樟子松提取物＞白皮松提取物＞青杄提取物＞白杄提取物;對供試真菌的抑菌作用表現(xiàn)最強(qiáng)的也分別是油松、樟子松、白皮松。

3.3 最小抑菌濃度的測定結(jié)果

表1:五種松科植物提取物對三種供試細(xì)菌最小抑菌濃度比較

通過表1可以看出，五種松科植物乙醇提取物對供試細(xì)菌的最小抑菌濃度差異較為明顯，油松的抑菌效果最好，對三種供試細(xì)菌的最小抑菌濃度均為0.5g/ml，即當(dāng)提取液濃度大于 0.5g/ml時，表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌作用。樟子松的提取物對三種供試細(xì)菌的最小抑菌濃度為 0.55g/ml－0.60g/ml，抑菌效果居中;其他三種松科植物的最小抑菌濃度均高于0.60g/ml以上才能表現(xiàn)抑菌作用，對三種供試細(xì)菌的抑菌作用都需要在較高濃度時才有所體現(xiàn)。

4 結(jié)論與討論

通過五種松科植物乙醇提取物對三種供試細(xì)菌和三種供試真菌進(jìn)行抑菌實驗結(jié)果表明:北方地區(qū)常見的松科植物中，油松和樟子松葉片提取物具有較強(qiáng)的抑菌作用，對三種供試細(xì)菌在較低濃度時就表現(xiàn)出一定的抑菌作用，而其它三種松科植物對三種供試細(xì)菌雖然表現(xiàn)出一定的抑菌作用，但是抑菌作用需要在濃度較高時體現(xiàn)。

實驗僅采用了乙醇做提取溶劑，因而不一定能將極性和非極性較強(qiáng)的生物活性物質(zhì)全部提取出來。由于時間和條件限制并未做多種極性不同溶劑之間的平行提取，今后如進(jìn)一步研究應(yīng)盡量采用各種極性不同的溶劑做平行提取。

植物的活性成分與植物的生長情況和分布情況有很大的關(guān)系，這會導(dǎo)致植物提取物的質(zhì)量也會有差別。本實驗是用植物粗提物進(jìn)行測試，但有些植物樣品中活性成分甚微，因而在供試濃度下未表現(xiàn)較強(qiáng)的活性。另外，對于殺菌劑而言，有的在離體條件下沒有活性，但在活體植物上則表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性，實驗僅初步進(jìn)行了離體實驗。這些在今后的研究中應(yīng)引起注意。

如何對北方地區(qū)廣泛種植的其它松科或者其它常綠植物進(jìn)行藥用提取物方面的進(jìn)一步開發(fā)利用是我們要進(jìn)一步開展的課題。

［1］何衍彪，詹儒林，趙艷龍.植物源農(nóng)藥的研究與應(yīng)用［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，24(3):48 －56.

［2］李園園，郝雙紅，萬大偉，厲建燕，孫偉光，孟昭禮.側(cè)柏乙醇提取物對21種植物病原真菌的抑菌活性.［J］西北植物學(xué)報，2008，(5):70 －78.

［3］劉菲，蔡小寧，楊平，馬軍，賁愛玲.32種植物提取物對常見植物病原真菌的抑制作用的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，(12):116 －121.

［4］包麗華，王林，張國盛，郭秀艷.水蒸氣蒸餾法提取臭柏細(xì)枝葉精油的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，(9):125－131.

［5］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗［M］.北京:高等教育出版社，2001，49 －74.

［6］白潔，王艷梅，趙強(qiáng).天山花楸全株抑菌作用的比較［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):125 －127.

［7］Koenraadt，H.，Somerville，S.C.，Jones，A.L.Characterization of mutations in the beta－tubulin gene of benomyl－resistant field strains of Venturia inaequalis and other plant pathogenic fungi［J］.phytopathology，1992，82(11):1348 －1354.

［8］耿劍鋒，黑田克利，田中一久.洋蔥油和大蒜提取物對灰霉菌的作用效果［J］.中國蔬菜，2008，(5):20 －22.

［9］孟祥東，傅俊范，嚴(yán)雪瑞.灰霉病菌生物防治研究進(jìn)展［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，34(6):472 －475.

［10］張佳，王瑩，張峰等.濾紙片法測定黃花蒿提取物對霉菌的抑制活性［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，48(5):1153－1154.

［11］Kawchuk，L.M.，Hutchison，L.J.，Verhaeghe，C.A.，et al.Isolation of the β － tubulin gene and characterization of thiabendazole resistance in Gibberella.pulicaris［J］.Can.J.Plant Pathol，2002，24:233 －238.

［12］王興全，等.蒼耳提取物對番茄灰霉病菌抑制機(jī)理的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，43(6):107 －110.

［13］Edlind，T.D.，Henry，K.W.，Metera，K.A.，et al.Aspergillus fumigatus CYP51 sequence:potential basis for fluconazole resistance［J］.Med Mycol，2001，39:299 －302.

［14］Sierrotzki，H.，Parisi，S.，Steinfeld，U.，et al.Mode of resistance to respiration inhibitors at the cytochrome bc1 enzyme complex of Mycosphaerella fijiensis field isolates［J］.Pest Management Sci，2000，56:833 －841.

［15］李宏，姜懷春.貫葉連翹總提取物對致病細(xì)菌的抗菌作用［J］.廣西植物，2007，27(3):466 －468.

［16］Takayuki，M.，Kaori，K.，Tomohiro，O.，et al.A two －component histidine kinase of the rice blast fungus is involved in osmotic stress response and fungicide action［J］.Fungal Genetics and Biology，2005，42:200 －212.

［17］盧婷，樸香淑.連翹提取物抗氧化活性的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧雜志，2009，45(15):57 －60.

［18］程曉麗，肖晴，劉明星，顏學(xué)滔，楊務(wù)彬.連翹乙醇提取物對小鼠抵御傷寒沙門菌感染能力的研究［J］.中國藥師，2009，12(4):435 －438.

［19］尹樂樂，曾耀英，侯會娜.連翹提取物對膿毒血癥小鼠及體內(nèi)T淋巴細(xì)胞影響［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)2009，29(5):392－396.

［20］胡文靜，錢曉萍，涂云霞，沈澤天，禹立霞，劉寶瑞.連翹乙醇提取物抗腫瘤作用的實驗研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，23(6):379－382.