邢曉東

(遼寧工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，遼寧 錦州121001)

阿爾茨海默病(AD)是一個漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為繼心血管疾病、癌癥、中風(fēng)之后的第四大死亡原因。其最典型的病理性改變是的神經(jīng)細(xì)胞間出現(xiàn)大量以β-淀粉樣肽為核心的老年斑、神經(jīng)元的胞體中出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生等。AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，但自由基損傷學(xué)說和細(xì)胞凋亡學(xué)說備受人們的關(guān)注。自由基形成和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，進(jìn)一步引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致AD的功能退化和神經(jīng)變性的基礎(chǔ)。AD模型鼠腦中MDA水平較對照組顯著升高，高水平的MDA表達(dá)經(jīng)常與神經(jīng)元纖維纏結(jié)及老年斑相伴隨出現(xiàn)。并且臨床研究表明，阿爾茨海默病患者血清中SOD和GSH-Px活性明顯降低，而這兩種酶是人體內(nèi)在抗氧化方面有著重要作用。(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯是綠茶的一種主要多酚成分，許多研究已經(jīng)揭示了EGCG的生物活性與其抗氧化特性緊密相關(guān)。為探討觀察綠茶提取物(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對自然衰老大鼠模型學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，并初步探討其作用機(jī)制，本實驗選用22～24月齡SD大鼠，應(yīng)用自然衰老大鼠篩選法制作AD模型，以EGCG灌胃給藥進(jìn)行治療，利用行為學(xué)實驗及化學(xué)比色法觀察EGCG對衰老AD鼠的治療作用，并進(jìn)一步探討其抗氧化的作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Morris水迷宮裝置購自北京碩林苑生物科技有限公司；生物研究顯微鏡購自日本尼康科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

EGCG，純度＞95%，購自 Sigma公司；超敏 SP濃縮(鼠/兔)試劑盒，產(chǎn)品編號KIT-0310，購自北京中杉金橋有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，產(chǎn)品編號ZB-2301，購自北京中杉金橋有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒均購自南京建成生物試劑有限公司。

1.1.3 實驗動物模型的分組及給藥

將造模成功的AD大鼠按各鼠平均逃避潛伏期的長短排序，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為：模型組、EGCG治療組，每組11只，共2組；將5～6個月青年大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)抽取11只，作為對照組。水迷宮測試結(jié)束后即開始對入組動物進(jìn)行灌胃給藥，EGCE治療組按照2mg/Kg.d的劑量灌胃給予EGCG；模型組和對照組給予等量蒸餾水灌胃。各組每天給藥1次，連續(xù)給藥30天

1.2 行為學(xué)觀察

水迷宮試驗：

參照Morris方法進(jìn)行。從灌胃第24天進(jìn)行水迷宮實驗，實驗訓(xùn)練階段連續(xù)進(jìn)行2天，每天訓(xùn)練2次。第24天開始記錄數(shù)據(jù)，標(biāo)記為數(shù)據(jù)表中的第1天，共4天。

1.3 海馬內(nèi)SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的測定

行為學(xué)實驗結(jié)束后，將各組大鼠每組取6只，斷頭處死，冰上快速取海馬，入液氮及-80℃中凍存。檢測時將海馬加入預(yù)冷的生理鹽水制成10%的腦勻漿，2000rpm/min離心10min，取上清。腦組織SOD、GSH-PX活性及MDA含量的測定，具體操作均按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用spss16.0版本軟件包統(tǒng)計軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較采用方差分析采用ANOVA、Mauchy's Test of Sphercity、LSD's post hoc test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果分析

在定位巡航試驗中，模型組大鼠的尋找平臺的潛伏期較對照組大鼠明顯延長(P<0.01)，而EGCG組大鼠的尋找潛伏期與模型組大鼠比明顯縮短(P<0.01)；在空間探索實驗中，模型組大鼠的尋找原平臺的潛伏期較對照組大鼠明顯延長(P<0.05)，而EGCG組大鼠的尋找潛伏期與模型組大鼠比明顯縮短(P<0.01)，而在目的象限的停留時間這一指標(biāo)上，模型組大鼠在平臺所在象限的的時間較對照組大鼠明顯縮短(P<0.01)，而EGCG組大鼠在目的象限的時間與模型組大鼠比明顯延長(P<0.05)；就在目的象限逗留的百分率而言，模型組大鼠在目的象限逗留的百分率較空白對照組大鼠明顯縮短(P<0.05)，而EGCG組大鼠在目的象限逗留的時間百分率與模型組大鼠比明顯延長(P<0.01)。表明模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶及判斷能力下降，而EGCG改善了AD衰老模型鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

3 討論

理想的動物模型的建立是研究AD的基礎(chǔ)。迄今為止，建立AD動物模型的方法很多，其中AD自然衰老模型鼠國外一些實驗室廣泛用于衰老和AD發(fā)病機(jī)制及藥物開發(fā)的研究。AD是一種年齡相關(guān)疾病，衰老因素在AD發(fā)病過程中扮演著重要角色，衰老所特有的病理生理變化及其它病變的影響，是用年輕動物制作的動物模型所不能替代的，選擇帶有認(rèn)知和記憶嚴(yán)重缺失的個體，其病理行為表現(xiàn)與老年人和AD患者的認(rèn)知損害相類似，同時還可出現(xiàn)某些相應(yīng)的腦組織病理改變。該模型的特點是自然衰老，其神經(jīng)系統(tǒng)的損害亦屬自然發(fā)生。由于AD的發(fā)病機(jī)制未明，目前所用的藥物造模和基因敲除造模方法制造的AD模型不能完全代表AD疾病的所有特點，而自然衰老的大鼠是通過一定標(biāo)準(zhǔn)的篩選制造的模型，就如同自然發(fā)病的AD患者，能夠較全面的代表AD疾病的特點。而且AD本身是一種老年疾病，目前藥物造?；蚧蚯贸睦鲜蠖酁榍鄩涯辏谏窠?jīng)系統(tǒng)、行為認(rèn)知方面也許可以模擬AD的特點，但是從總體研究的角度來說，不如自然衰老模型的大鼠更具有代表性?？傊?，AD衰老模型鼠模型成功的模擬了AD的行為學(xué)及病理學(xué)改變，可用于AD的藥物治療研究。

(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯是綠茶的一種主要多酚成分，研究證實綠茶有效的鐵螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神經(jīng)保護(hù)等作用的發(fā)揮主要依賴于EGCG通過研究人大鼠成纖維細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EGCG使產(chǎn)生非淀粉樣變性的可溶性APP(sAPP)的表達(dá)水平提高，延緩衰老大鼠自由基氧化損傷。由此提示了EGCG對神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。本實驗證實了EGCG對AD衰老模型大鼠氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，EGCG能夠明顯改善自然衰老大鼠的認(rèn)知功能，提高大腦內(nèi)的SOD、GSH-Px活性和減少了MDA的含量，證實EGCG主要的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與其抗氧化作用有關(guān)，至于其他相關(guān)的作用機(jī)制，仍有待于作進(jìn)一步的研究探討。