白春英,于曉明,史鐵偉,瑞云

（1.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心；2.赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

優(yōu)化多重PCR檢測Duchenne muscular dystrophy基因外顯

白春英1,于曉明2,史鐵偉1,瑞云1

（1.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心；2.赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

白春英，女，蒙古族，2008年3月畢業(yè)于日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)系，獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位。研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。2008年9月進(jìn)入赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院工作，現(xiàn)任醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心主任，副教授。承擔(dān)《臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》、《醫(yī)用生物學(xué)》、《細(xì)胞生物學(xué)》和《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》及公選課《常見遺傳病的特征及分子基礎(chǔ)》等教學(xué)工作。

目的：介紹一種快速簡便地優(yōu)化多重PCR檢測DMD基因外顯子缺失的方法及詳細(xì)步驟.方法：采2m l外周血，用0.2%氯化鈉處理收集白細(xì)胞，再用基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA,用優(yōu)化的多重PCR法直接檢測DMD基因外顯子的缺失.結(jié)果：用該方法檢測DMD基因外顯子缺失結(jié)果準(zhǔn)確清晰.結(jié)論：用優(yōu)化的多重PCR技術(shù)可以直接檢測DMD基因外顯子缺失，跟通常使用的9對引物一步法相比，具有經(jīng)濟(jì)、快速、簡便等特點(diǎn).

優(yōu)化；多重PCR；Duchenne muscular dystrophy(DMD)；缺失

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchennemuscular dystrophy,DMD）是最常見的X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，發(fā)病率為1/3 500個(gè)男孩.患兒的主要表現(xiàn)為進(jìn)行性骨骼肌無力和萎縮，由于臀中肌無力而行走時(shí)呈鴨步，因腹肌和腰肌無力而致下蹲起立時(shí)出現(xiàn)高爾斯征（Gower’s sign）.病情中后期呈明顯的全身肌肉萎縮，60%-90%的患兒伴有心肌受累，最終于20歲左右因心肌、呼吸肌萎縮導(dǎo)致心肺功能衰竭而死亡. DMD基因位于X染色體上，全長2500kb，有79個(gè)外顯子. DMD基因突變以缺失為主，占DMD基因突變的55%-65%，主要分布在基因的上游和中部區(qū)域.多重PCR（multiplexPCR）是在同一擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對以上的引物，對一個(gè)DNA樣品中多個(gè)靶序列片段進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增.當(dāng)被檢基因較大、突變位點(diǎn)較多時(shí)，用多重PCR能夠在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)檢測出多個(gè)突變.

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小

1 材料與方法

1.1 引物合成與稀釋

[1]合成DMD基因9個(gè)常見的缺失外顯子(4,8,12,17,19,44,45,51)（北京賽百盛公司）.9對引物在DMD基因中的位置、序列和擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小見表1（按擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小排列）.優(yōu)化前，我們將9對引物制備成混合液，使每條引物的終濃度為0.5μmol/L.

1.2 模板的制備

采正常對照、患兒及其母親外周血各2ml-3ml，用0.2%氯化鈉處理收集白細(xì)胞，再用基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA,具體方法見參考文獻(xiàn)[2].檢測基因組DNA的濃度和純度，使模板的濃度為100-150ng/μl.

1.3 多重PCR

優(yōu)化前，為了摸索條件分成了四個(gè)組，第一組按順序加入下列物質(zhì)：滅菌超純水13μl，2xPCR Mastermix(Bioteke, Beijing,China)25μl，混合引物10μl，DNA模板(選2個(gè)正常對照)2μl，總體積50μl.短暫離心混勻，放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)準(zhǔn)備擴(kuò)增.擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性7min，55℃復(fù)性1min后進(jìn)入循環(huán).循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)椋ㄑ由?、變性、退火）?2℃延伸2min，96℃變性30s，56℃退火1.5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min.第二組的反應(yīng)液中先不加人PCR mix，在96℃預(yù)變性7min后，在變性結(jié)束溫度降至60℃左右時(shí)，暫停PCR儀加入PCR mix，其他條件同第一組.第三組的反應(yīng)體系同第一組，不同于第一組的是循環(huán)擴(kuò)增程序設(shè)置為普通PCR的循環(huán)程序（變性、退火、延伸）.第四組與第三組的不同點(diǎn)為反應(yīng)體系中后加PCR mix，其他都相同.

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化前的結(jié)果

10μl PCR產(chǎn)物于2%普通的瓊脂糖凝膠中分離.在1 X TAE電泳緩沖液中電泳，電壓為5V/cm，電泳時(shí)間1.5h.優(yōu)化前的結(jié)果見圖1，每相鄰的泳道樣品為同一基因組，結(jié)果顯示第一組的條帶最為清晰，但從上面數(shù)第2-7條帶之間的界限模糊，無法判斷是否有缺失，需要優(yōu)化反應(yīng)條件.

圖1 未優(yōu)化前多重PCR電泳檢測結(jié)果

2.2 優(yōu)化后的結(jié)果

優(yōu)化后，我們將原本混入一管的引物分成了2管，使相鄰的2-7條帶分成2管，加大了條帶之間的間距，將48、17、8外顯子引物混合加入B管，其余的引物（45、19、51、12、44、4）混合入A管，每條引物的終濃度為0.5μmol/L.反應(yīng)條件我們選用了第一組，PCR mix直接加入反應(yīng)體系中，擴(kuò)增條件為：96℃預(yù)變性7min，55℃復(fù)性1min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)椋ㄑ由?、變性、退火）?2℃延伸2min，96℃變性30s，A管56℃（B管55℃）退火1.5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min.電泳條件與優(yōu)化前相同，結(jié)果見圖2.電泳結(jié)果清晰，所有的條帶之間的界限清晰，泳道4和7為患兒的DNA,可以準(zhǔn)確地判斷患兒所有細(xì)胞DMD基因的第51個(gè)外顯子完全缺失，部分細(xì)胞DMD基因第48外顯子有缺失（有條帶但很弱）,而患兒母親的這9個(gè)外顯子完全正常,圖2的3和6泳道為患兒母親的DNA.

圖2 優(yōu)化后多重PCR電泳檢測結(jié)果

3 討論

3.1 優(yōu)化后各個(gè)條帶之間的界限明顯，條帶清晰，對基因缺失能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷.而且B管的退火溫度設(shè)定為55℃后條帶更為清晰.

3.2 對比其他檢測DMD缺失的方法[1,3]，我們的電泳使用的是實(shí)驗(yàn)室最常用的瓊脂糖膠，不需要定購低熔點(diǎn)瓊脂糖和聚丙烯酰胺，而且普通瓊脂糖凝膠電泳比聚丙烯酰胺凝膠電泳方便簡單，對比低熔點(diǎn)瓊脂糖價(jià)格便宜.

3.3 若九對引物混在一個(gè)管內(nèi)，因普通瓊脂糖凝膠電泳分辨率低，第2-7條帶之間很難分離，必須要延長電泳的時(shí)間（2h-4h）[4]，加大了電泳的難度.而采用我們的方法,把相鄰條帶分成了兩管，使條帶之間的間距加大，只要1.5h就可以使條帶分離，跟普通的電泳沒有什么區(qū)別.

3.4 對比文獻(xiàn)[5]的普通PCR檢測DMD基因缺失的方法，檢測9個(gè)外顯子就需要9管PCR反應(yīng)，而我們的多重PCR法只需要2管，操作簡單了許多同時(shí)也可以節(jié)省PCR反應(yīng)試劑.

綜上所述，我們優(yōu)化后的多重PCR技術(shù)兼?zhèn)淞似胀≒CR的準(zhǔn)確性與9對引物法的便捷性，且操作簡單，適合在多種環(huán)境下進(jìn)行基因診斷，值得推廣.

參考文獻(xiàn)：

〔1〕徐克前.分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.165-168.

〔2〕白春英,周靜,瑞云,等.經(jīng)濟(jì)、有效提取全血基因組DNA的方法[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(17):1795-1798.

〔3〕閆楊,楊曉鳳,尹富華,等.135例Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥DMD基因缺失分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2009,29(8): 872-874.

〔4〕杜文津,萬琪,陳晉文,等.假肥大肌營養(yǎng)不良基因突變檢測方法的應(yīng)用比較[J].卒中與神經(jīng)疾病,2010,17(5):289-292.

〔5〕周海燕,鄒永華.應(yīng)用PCR技術(shù)對DMD患者進(jìn)行缺失檢測與產(chǎn)前診斷[J].生命科學(xué)研究,2006,10(4):346-349.

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1673-260X（2014）07-0014-02