劉 軍

Ebselen預處理對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌結構和功能的保護及可能機制研究

劉 軍1,2

目的：通過研究Ebselen在大強度耐力訓練大鼠疲勞發(fā)生過程中對于骨骼肌活性氧和活性氮自由基的清除，細胞凋亡的調(diào)控等方面的作用機制，為Ebselen應用于抗疲勞領域提供實驗依據(jù)。方法：雄性健康SD大鼠30只，跑臺預適應淘汰不適應跑臺運動者后，將剩余大鼠隨機分為安靜對照組(CG)、運動對照組(TG)和Ebselen預處理運動組(TEG)，每組8只。Ebselen預處理運動組灌服Ebselen+DMSO生理鹽水溶液，安靜對照組和運動對照組灌服等量DMSO生理鹽水。8周大強度耐力跑臺運動訓練后，分別檢測大鼠股四頭肌內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px，活性氮自由基、凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax等指標，TUNEL檢測細胞凋亡，透射電子顯微鏡觀察骨骼肌超微結構。結果：大強度耐力訓練后大鼠骨骼肌內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px活性下降(P<0.05)，總抗氧化能力TAOC下降，自由基代謝產(chǎn)物MDA水平升高(P<0.01)；活性氮自由基NO及NOS含量升高；Bax/Bcl-2下降(P<0.01)，凋亡指數(shù)AI升高(P<0.01)，骨骼肌超微結構完整性明顯受損；相比運動對照組，Ebselen預處理后，運動大鼠骨骼肌SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，TAOC升高，MDA及NO水平下降(P<0.05)，Bax /Bcl-2上升，凋亡指數(shù)AI降低(P<0.01)，骨骼肌超微結構得到明顯保護。結論：Ebselen可以發(fā)揮擬似GSH-Px活性，提高骨骼肌內(nèi)源性抗氧化酶活性，加快運動中活性氧與活性氮自由基降解，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，發(fā)揮抗細胞凋亡作用，延長大鼠跑臺運動至力竭的時間，有效保護骨骼肌結構的完整性。

Ebselen；大強度耐力訓練；骨骼?。粌?nèi)源性抗氧化酶；細胞凋亡；鼠；動物實驗

運動疲勞是運動醫(yī)學研究的經(jīng)典領域，最早始于1880年，莫索(Mosso)以骨骼肌為研究對象開創(chuàng)疲勞研究[26]。來自大腦的神經(jīng)信號使肌肉收縮產(chǎn)生張力，作用于骨骼并使其圍繞關節(jié)發(fā)生運動，完成運動指令。后來，學界將疲勞按發(fā)生的部位分為中樞疲勞和外周疲勞，有研究者將中樞神經(jīng)系統(tǒng)對運動神經(jīng)元的有效募集失敗歸為中樞疲勞[38]，而發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處或者骨骼肌本身的影響肌肉做功的因素則歸為外周疲勞。所以，運動中保持骨骼肌結構和功能的完整性對運動能力的影響至關重要。

有研究表明[3，7]，過量運動可引起骨骼肌線粒體Ca2+增加，自由基產(chǎn)生增多并誘發(fā)骨骼肌細胞凋亡，進而影響運動能力。Ebselen又稱PZ51，化學名稱2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3[2H]- one，是一種脂溶性的小分子有機硒化合物，在體內(nèi)能夠模擬谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，具有抗炎、抗氧化和防止缺血與氧應激導致的細胞凋亡等功能[1，16，29]，由此開展的相關研究包括其對神經(jīng)細胞氧化損傷的保護[31]，如臨床研究顯示，Ebselen早期干預可以有效改善急性腦缺血、中風[45]和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病[43]的預后，還可通過抗氧化阻止酒精導致的早期肝損傷發(fā)生[22]。近期也有研究表明，Ebselen對骨骼肌軟組織損傷后的微循環(huán)重建有良好療效，可以通過降低炎癥細胞反應而防止骨骼肌免受白細胞依賴的繼發(fā)性炎癥組織損傷，改善骨骼肌效能[19]。以上研究提示，Ebselen可能能夠通過清除自由基、抑制細胞凋亡等功能而對運動導致的骨骼肌損傷產(chǎn)生保護作用。本研究以大鼠為研究對象，建立大強度耐力訓練疲勞模型，同時服用Ebselen，觀察對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌超微結構、細胞內(nèi)源性抗氧化物(native antioxidants，AOX)、對活性氧(reactive oxygen species， ROS) 及活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)自由基的清除能力、細胞凋亡及其調(diào)控蛋白的影響，為尋找更多的抗疲勞藥物，使Ebselen應用于延緩運動疲勞領域提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及跑臺運動疲勞模型的建立

雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，動物購自陜西中醫(yī)研究所實驗動物中心。自由飲食，分籠飼養(yǎng)備用。動物適應性飼養(yǎng)3天后，進行為期3天的運動篩選，運動負荷為15 m/min，5 min/天。淘汰不能適應跑臺訓練的大鼠。剩余大鼠隨機分為安靜對照組(CG)、運動對照組(TG)和Ebselen預處理運動組(TEG)，每組8只。跑臺運動時，當大鼠臀部壓在籠具后壁，跟不上預定速度并隨轉(zhuǎn)動皮帶后拖30 s、經(jīng)毛刷刺激驅(qū)趕仍然不能運動時界定為疲勞狀態(tài)[5]。訓練前，先以15 m/min的速度適應5 min，訓練方案基于Bedford等模型[8，11]修改，為期8周，每周訓練5天，周末休息。實驗方案如下：第1周速度為15 m/min，運動時間為20 min/天；第2周速度為20 m/min，運動時間20 min/天；第3周速度為25 m/min，運動時間為20 min/天；第4周速度為25 m/min，運動時間為30 min/天；第5周速度為30 m/min，運動時間為30 min/天；第6周速度為30 m/min，運動時間為40 min/天；第7周速度為35 m/min，運動時間為40 min/天；第8周速度為35 m/min，運動時間為40 min/天。第8周最后1天使動物跑臺運動至力竭，記錄力竭運動時間后麻醉取材。

1.2 Ebselen及補充方法

Ebselen購自成都兢鵬生化科技有限公司，純度大于98%。將藥物溶于5%的DMSO(sigma)生理鹽水溶液中[2]，對Ebselen預處理運動組大鼠在跑前30 min實施灌胃，根據(jù)文獻將有效劑量確定為50 mg/kg/天[6,14]，另外，2組灌服等量的DMSO生理鹽水作為對照，灌胃量均為1 mL/100 g體質(zhì)量[2]。

1.3 實驗動物取材及樣品處理方法

實驗動物完成運動疲勞建模最后1天，將大鼠稱重后乙醚麻醉，斷頭處死，迅速剝離股四頭肌，切取2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，立即置于2.5%戊二醛固定液中4℃固定用于透射電子顯微鏡觀測；切取部分組織于4%的中性甲醛溶液中固定以備免疫組織化學檢測。其余組織制備組織勻漿，離心后分離出上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測試指標及方法

1.4.1 自由基及抗氧化指標測試

稱取0.2～1 g骨骼肌，按比例加入0.86%冷生理鹽水，重量體積比為1∶9，將組織塊用眼科剪刀剪碎，手工研磨制備勻漿液，低溫離心(3 000轉(zhuǎn)/min，15 min)后吸取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導性一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)測試均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，蛋白定量采用雙縮脲法。

1.4.2 骨骼肌細胞凋亡的檢測

1.切片制備與免疫組織化學染色

Bcl-2、Bax蛋白表達檢測采用武漢博士德生物工程有限公司提供的試劑盒。標本經(jīng)固定、石臘包埋、連續(xù)切片、貼片。切片脫臘至水后經(jīng)抗原修復，封閉，一抗、二抗孵育等過程。染色采用SABC法，DAB顯色。每次染色時用PBS取代一抗成陰性對照一張。封片，顯微鏡觀察后掃描灰度值。

2.原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測骨骼肌凋亡細胞

骨骼肌標本經(jīng)固定后包埋。TUNEL檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照實驗流程操作，DAB顯色后在顯微鏡下觀察陽性細胞個數(shù)。當細胞核中有棕黃色顆粒時視為陽性細胞。每張切片在高倍鏡下隨機選取5個視野，對陽性細胞進行計數(shù)。選取凋亡指數(shù)反應骨骼肌細胞的凋亡情況。凋亡指數(shù)(AI)具體計算方法為視野內(nèi)凋亡骨骼肌細胞數(shù)/視野內(nèi)所有細胞數(shù)×100%。

1.4.3 透射電子顯微鏡的觀測

骨骼肌樣品經(jīng)固定、包埋、定位(光學顯微鏡下)，切片(50～70 nm)、染色(1%醋酸鈾2 h，檸檬酸鉛)、拍照觀察(日本日立 H-600透射電子顯微鏡)。

1.5 圖像分析與統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 Ebselen預處理對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌AOX和RNS的影響

圖 1 本研究Ebselen預處理對大鼠骨骼肌AOX和RNS的影響示意圖Figure 1. Effects of Ebselen Pretreatment on the AOX and RNS of Skeletal Muscle in Rats

注： *表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)。

由圖1可知，相比CG，TG股四頭肌內(nèi)抗氧化酶GSH-Px、SOD、Cu-ZnSOD等活性均顯著下降，自由基代謝產(chǎn)物MDA含量顯著升高，總抗氧化能力下降但不具有顯著性差異，NOS升高(P>0.05)，iNOS顯著升高，NO含量顯著升高；相比TG，TEG GSH-Px、SOD、Cu-ZnSOD等酶活性均有顯著性改變，但GSH-Px仍未達到安靜時水平；MDA含量顯著下降且仍然高于安靜時水平；總抗氧化能力有所回升，且高于CG水平，差異具有顯著性，NOS仍然升高，iNOS有下降但不具顯著性差異，NO含量下降但仍然顯著高于CG。

2.2 Ebselen預處理對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌細胞凋亡及調(diào)控蛋白的影響

由圖2可知，大強度耐力訓練導致大鼠骨骼肌細胞Bcl-2的灰度值顯著升高(P<0.05)，Bax顯著性下降(P<0.01)，Bax /Bcl-2顯著下降(P<0.01)；AI顯著升高(P<0.01)；相比TG，TEG Bcl-2灰度值顯著下降(P<0.01)，Bax顯著升高(P<0.01)，Bax /Bcl-2顯著升高(P<0.01)；AI顯著升高(P<0.01)。

圖 2 本研究Ebselen預處理對大鼠骨骼肌細胞凋亡及調(diào)控蛋白的影響示意圖Figure 2. Effects of Ebselen Pretreatment on the Apoptosis and Regulatory Protein of Skeletal Muscle in Rats

2.3 Ebselen預處理對跑臺訓練大鼠力竭時間的影響

由圖3可知， Ebselen預處理顯著延長了大鼠跑臺運動至力竭的時間(P<0.05)，相比TG，提高了26.98%。

圖 3 本研究Ebselen預處理對大鼠跑臺運動至力竭時間的影響示意圖Figure 3. Effects of Ebselen Pretreatmenton Exercise Time to Exhaustion of Rats

2.4 骨骼肌的透射電鏡觀察

Ebselen預處理對大鼠骨骼肌超微結構的影響如圖4所示。

3 分析與討論

3.1 Ebselen對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌ROS與AOX的影響

圖 4 本研究Ebselen預處理對大鼠骨骼肌超微結構的影響示意圖Figure 4. Effects of Ebselen Pretreatmenton Skeletal Muscle Ultrastructure in Rats

注：線粒體(Mitochondrion，Mi)； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)； 糖原顆粒(Glycogen,Gn)； 細胞核(Nuclear,N)。

研究人類運動促進氧應激的報道出現(xiàn)至少已經(jīng)超過30年，ROS在肌肉疲勞發(fā)展中的角色一直受人關注。肌肉疲勞是一種運動導致的產(chǎn)生最大肌肉力量的能力降低的生理現(xiàn)象[17]。在肌肉處于靜息狀態(tài)時活性氧產(chǎn)生率較低，而在收縮狀態(tài)時產(chǎn)生較高[27]。肌肉中ROS的產(chǎn)生與熱應激、缺血再灌注損傷、肌肉刺激等因素有關。運動時高水平ROS產(chǎn)生可以損害細胞成份[33]。ROS的主要形式過氧化氫和過氧化物在很多生物進程中都扮演重要角色，有研究顯示，運動期間自由基和ROS產(chǎn)物的大部分是由骨骼肌產(chǎn)生[31]，研究其可能來自于從呼吸鏈到氧的單電子泄露，在呼吸過程中，很多氧在氧化磷酸化期間通過生成水的方式降解，但仍然有一小部分(約0.15%)的氧可以生成超氧化物和過氧化氫的形式降解[49]。

研究顯示，黃嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶在骨骼肌重復性收縮和力竭運動中具有重要作用。來自于黃嘌呤氧化酶的ROS生成與嚴重的壓力應激如力竭運動關系更為密切[42]。在肌肉收縮時，ROS產(chǎn)生和抗氧化劑的活性能夠影響肌肉力量的產(chǎn)生。因為氧化應激導致ROS和AOX水平之間的失衡，尤其當ROS生成過多，不再能被AOX很好地緩沖，這可能降低肌肉的收縮功能，更大強度地刺激或不能恢復的疲勞運動方案會引起肌肉收縮減弱，導致ROS生成的顯著性增加，使得AOX在疲勞發(fā)展過程中起到顯著性作用。細胞內(nèi)AOX主要包括SOD、CAT、GSH和硫氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)等[30]。通過清除過多的ROS，細胞內(nèi)這些抗氧化劑修飾細胞氧化還原狀態(tài)和氧化還原敏感的代謝過程，降低肌肉損傷，在代謝失衡的情況下保護最大能源供給，因為上述這些被糾正的因素在疲勞情況下都可能發(fā)生[13]。

本研究中，大強度跑臺耐力訓練后疲勞大鼠的自由基代謝產(chǎn)物MDA生成增加，SOD、GSH-Px等AOX抗氧化酶顯著降低，表明這些酶參與了疲勞發(fā)生過程中自由基的清除。Cu-ZnSOD是SOD的一種亞型，是SOD的主要存在形式，在胞液中催化由線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈、肌漿網(wǎng)NADPH氧化酶系統(tǒng)和磷脂酶A2(PLA2)依賴的進程中等產(chǎn)生的超氧陰離子[17]。本實驗中，該酶也顯著減少，而總抗氧化能力降低。在服用Ebselen干預后，上述各項指標均發(fā)生比較好的改變，體內(nèi)主要的AOX酶如SOD和GSH-Px均顯著增加，這可能與Ebselen可以模擬胞內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑，協(xié)助GSH去清除H2O2等有關。Li Zuo[48]等在非洲爪蟾蜍分離出來的完整肌纖維中，在肌肉強直收縮時實時測得ROS，并且觀察到相比靜息狀態(tài)，收縮活動會誘導ROS產(chǎn)生顯著增加，而ebselen處理可以降低ROS的產(chǎn)生，這與本實驗研究結果部分一致。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，Ebselen還是一種硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的優(yōu)良底物，能夠降低Trx的一種高效氧化劑，可以催化H2O2還原[46]。在較低濃度時，它還可抑制一系列與炎癥相關的酶，包括脂氧合酶、NOS、NADPH氧化酶、PKC、H+/K+-ATP酶等從而發(fā)揮作用，它還可以通過TRX過氧化物酶抑制細胞內(nèi)非酶和酶的脂質(zhì)過氧化[37]。

3.2 Ebselen對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌RNS的影響

在運動中，骨骼肌除產(chǎn)生活性氧自由基外還有RNS自由基，后者主要來源于NO。NO既可以在一些重要的細胞進程中作為信號分子，又是體內(nèi)RNS的主要來源[41]。在骨骼肌收縮等生理功用中扮演重要角色，它由NOS合成，NOS有3種亞型，分別是神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS) 和誘導型NOS(iNOS)，在骨骼肌中均有表達，但炎癥時更多表達的為iNOS[40]。NOS亞型的活性則主要受胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)節(jié)[47]。與ROS的損害在動物肌肉疲勞中的直接作用相比，NO的產(chǎn)生直接導致疲勞的發(fā)展方面的證據(jù)仍然有限。理論上，NO作用于肌肉中的效應蛋白如收縮和鈣調(diào)控蛋白而產(chǎn)生力量，因此，似乎能夠促使肌肉疲勞，然而，文獻并不支持NO直接導致肌肉疲勞[28]。NO和超氧陰離子的反應生成過氧亞硝酸鹽，后者正是NO產(chǎn)生毒效應的作用途徑之一。過氧亞硝酸基是一個強力的硝化和氧化劑，它可以導致胞內(nèi)損傷和細胞死亡，因其可引起巰基、脂質(zhì)過氧化物的氧化和蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的硝化而形成硝基酪氨酸。RNS也影響肌肉興奮——收縮耦聯(lián)功能，后者是近年來研究中一致認為在骨骼肌疲勞中收縮能力下降的因素之一。RNS還作用于肌漿網(wǎng)阿諾堿受體(Ryanodine receptors,RyR)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+釋放，通過cGMP依賴的信號通路影響骨骼肌收縮能力[15]。

大強度運動訓練時，骨骼肌處于相對缺氧狀態(tài)，組織相對缺氧可能損害胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，從而通過NOS增加NO的產(chǎn)生。這與本研究結果一致：運動組大鼠相比安靜組NO顯著升高，NOS相應也升高。在藥物干預后，運動大鼠的這一趨勢則明顯受到抑制。有文獻證實，低氧可以增加心肌細胞活性氧的產(chǎn)生，而抗氧化劑能夠改善收縮能力[20]。也有文獻證實，在缺氧時抑制NOS可以改善大鼠膈肌收縮能力[10]，而Ebselen進入胞內(nèi)，可以通過模擬GSH-Px活性，催化過氧硝酸鹽降解；或者可以催化H2O2的降解，從而被認為間接清除超氧陰離子，完成對過氧硝酸鹽和NO的清除。

3.3 Ebselen對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌細胞凋亡及調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

由細胞內(nèi)ROS/RNS的過度產(chǎn)生或者/和胞內(nèi)抗氧化防御能力的下降所產(chǎn)生的刺激，都可能導致細胞凋亡[25]。Bcl-2家族是體內(nèi)調(diào)節(jié)細胞凋亡的一組蛋白，根據(jù)其結構和功能可以分為2個亞群，抗凋亡成員如Bcl-2，促凋亡成員如 Bax等。其家族成員之間能形成二聚體/多聚體從而調(diào)節(jié)細胞的存活與凋亡。如果Bcl-2表達的水平高于Bax，那么，細胞可以存活，反之則死亡。

有研究顯示，運動后骨骼肌發(fā)生細胞凋亡或者產(chǎn)生有益的抗凋亡作用，與運動強度、運動持續(xù)時間、運動后的恢復狀態(tài)等相關[4，39]。細胞凋亡引起骨骼肌細胞的微細結構損傷，使肌肉收縮能力和損傷后恢復能力下降[23]。本研究顯示，大強度耐力訓練后，運動對照組大鼠骨骼肌Bcl-2表達顯著下降(灰度值升高)，而Bax表達顯著升高；運動同時服用Ebselen后則有效逆轉(zhuǎn)這種趨勢。

Ebselen作為治療藥物保護由過氧化物釋放、獲得性免疫缺陷綜合癥、輻射暴露和其他病理條件下細胞免受凋亡之困方面的研究由來已久[34]。近來研究又提示，Ebselen在對抗嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)中NO誘導的細胞凋亡[36]、神經(jīng)細胞凋亡[44]等均有良好效果，其機制可能與Ebselen抑制了NO誘導的磷脂酰絲氨酸的暴露，細胞色素氧化酶C的釋放和Caspase-3的激活等有關。此外，也有可能與Ebselen阻礙了凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)的激活，抑制P38絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)和c-Jun 氨基末端蛋白激酶(JNK)的磷酸化有關。還可能與其激活P44/42MAPK，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)有關[44]。

3.4 Ebselen對大強度耐力訓練大鼠骨骼肌超微結構及跑臺運動能力的影響

本研究提示，在結構上，Ebselen預處理后明顯保護了大強度耐力訓練大鼠骨骼肌細胞結構的完整性，肌纖維排列整齊，沒有染色質(zhì)凝集、核碎裂等出現(xiàn)，凋亡細胞數(shù)量明顯減少；功能上，有效延緩了疲勞的發(fā)生，使大鼠跑臺運動至力竭時間延長了近1/4。機制除上述研究中提到的清除ROS、RNS和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的下降等之外，還可能與Ebselen可產(chǎn)生具有催化活性的硒醇而摸擬GPx活性[9，12]，清除H2O2防止AMPK的過度激活[21]，進而影響骨骼肌中葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力[35]，降低血管內(nèi)血栓形成和P選擇素在血小板上表達從而防止缺血再灌注損傷[24]，還可以在肌肉損傷后讓白細胞和血小板隔離，降低炎癥反應[18]。

4 結論

1.Ebselen可以有效保護大強度耐力訓練大鼠骨骼肌的結構和功能的完整性，顯著提高大強度耐力訓練大鼠跑臺運動至疲勞的時間。

2.這種保護機制可能是其發(fā)揮擬似GSH-Px活性，提高細胞抗氧化能力，加快運動中活性氧和活性氮自由基的降解，防止細胞過分暴露而受氧自由基、NO及其衍生物的毒害，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，進而通過凋亡調(diào)控蛋白Bax/Bcl-2而發(fā)揮抗細胞凋亡作用，有效保護骨骼肌結構和功能的完整。

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ProtectiveEffectsandPossibleMechanismofEbselenPretreatmentontheRatSkeletalMuscleStructureandFunctioninHighIntensityEnduranceTraining

LIU Jun1,2

Objective:Through analyzing the functional mechanism of ebselen in scavenging skeletal muscular reactive oxygen and reactive nitrogen and in regulating cell apoptosis during the process of fatigue in high-intensity endurance training,the research can provide experimental basis for ebselen to applied into the field of anti-fatigue.Methods:Thirty healthy male SD rats were randomly divided into the control group,exercise group and ebselen pretreatment exercise group after eliminate inadaptation treadmill exercise rats (n=8).Ebselen pretreatment add exercise group was gaster-poured by ebselen dissolved in 5% physiological saline solution with DMSO (50 mg/kg/d),and the rest group were poured with the same amount of placebo only.After intensive endurance training on the treadmill for 8 weeks,In situ DNA nick-end labeling (TUNEL) was used to detect apoptotic changes as an indicator of apoptosis.SOD,Cu/Zn-SOD,GSH-Px,MDA,TAOC,NO,NOS,iNOS express levels were determined by kits.Bcl-2 and Bax protein levels were estimated by immunohistochemistry.And skeletal muscle ultrastructure were illustrated with Transmission Electron Microscopy.Results:After intensive endurance training,the activity of endogenous antioxidant enzymes SOD,GSH-Px in the rat skeletal muscle decreased (P<0.05),total antioxidant capacity TAOC decreased,the level of MDA increased (P<0.01);the content of NO and NOS was elevated and Bax/Bcl-2 decreased (P<0.01),apoptosis index AI increased (P<0.01),the integrity of skeletal muscle ultrastructure was damaged significantly;Compared to the control exercise group,Ebselen pretreatment can increase the skeletal muscle SOD,GSH-Px activtiy,TAOC (P<0.05) and Bax/Bcl-2 (P<0.01),decrease the level of MDA,NO and AI (P<0.01),the ultrastructure of skeletal muscle

obvious protection.Conclusion:These findings may suggest that ebselen can protect the skeletal integrity of structure effectively,prolong the time that rat run on the treadmill until exhausted.The reason may be associated with that Ebselen can mimic activity of glutathione peroxidase,increase endogenous antioxidant enzyme activity in skeletal muscle,accelerate the degradation of reactive oxygen and reactive nitrogen species in the exercise,reduce the production of lipid peroxidation,inhibit the down-regulation of anti-apoptosis protein Bcl-2.

ebselen;highintensityendurancetraining;skeletalmuscle;nativeantioxidants;apoptosis；rat;animalexperiment

1000-677X(2014)07-0091-07

2013-11-08；

：2014-04-17

陜西省自然科學基金資助項目(2012JM4014)。

劉軍(1980-)，男，甘肅民勤人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動疲勞的機制與調(diào)控，Tel：(029)88409449；E-mail：liujun_0215@hotmail.com。

1.西安體育學院 健康科學系，陜西 西安 710068；2.北京師范大學 體育與運動學院，北京 100875 1.Xi’an Physical Education University，Xi’an 710068，China；2.Beijing Normal University，Beijing 100875，China.

G804.7

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