潘磊，徐亞芳，郭瑞，李佳楠，胡志輝，陳禪友*

（1.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北武漢430056；2.江漢大學生命科學學院，湖北武漢430056）

豇豆SSR標記在豌豆中的可轉移性與應用初探

潘磊1，2，徐亞芳1，2，郭瑞1，2，李佳楠1，2，胡志輝1，2，陳禪友*1，2

（1.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北武漢430056；2.江漢大學生命科學學院，湖北武漢430056）

利用豇豆SSR引物篩選在豌豆具通用性的SSR引物。13對豇豆SSR引物中檢測出8對引物在豌豆中可擴增，其中5對SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性，進而分析11個豌豆品種和5個豇豆品種的遺傳多樣性與遺傳關系。結果表明：平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均Shannon指數(shù)，在豌豆品種群中分別為2.00、1.64、0.55，豇豆品種群中分別為2.00、1.80、0.53，上述遺傳參數(shù)反映出供試豌豆品種和豇豆品種具有中等水平的遺傳多樣性；利用UPGMA聚類分析，能將豌豆品種群和豇豆品種群分為兩類，且每個品種群內的各個體之間能進行區(qū)分，尤其是兩個豌豆品種亞群的聚類結果與其地理來源基本一致。

豌豆；豇豆；SSR；可轉移性

豌豆（Pisum sativum L.）屬于豆科，蝶形花亞科，豌豆屬，為一年生攀援草本植物，起源于亞洲西部和非洲部分地區(qū)，有4個起源中心，即亞洲中部、近東地區(qū)、埃塞俄比亞和地中海地區(qū)［1-2］。豌豆是一種重要的豆類作物，已經成為第二大食用豆類［3］。豌豆適應性很強，富含營養(yǎng)物質，而且豌豆的鮮莢和干豌豆均可食用。其在世界范圍內廣泛種植，根據國際糧農組織統(tǒng)計，2011年全世界有108個國家和地區(qū)種植豌豆。

SSR為簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）的簡稱，又稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），是一段由1～6個堿基串聯(lián)重復組成的DNA序列，在真核生物基因組上隨機且廣泛分布。SSR分子標記具有數(shù)量多、共顯性遺傳、等位變異豐富、特異性強和重復性高等優(yōu)點。因此，SSR分子標記技術廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位以及遺傳圖譜的構建等。

近年來，豌豆SSR分子標記的研究越來越受到關注［4-7］。利用生物信息學技術方法，從豌豆EST（Expressed Sequence Tag，表達序列標簽）數(shù)據庫中開發(fā)出78個SSR標記［8-9］。P.Kumari等［10］采用32個SSR標記揭示了28份印度豌豆品種具有中等水平遺傳多樣性以及品種間的親緣關系。宗緒曉等［6，11］利用SSR分子標記對我國豌豆栽培品種和地方品種進行了核心種質資源構建、遺傳結構分析和遺傳多樣性水平分析。盡管如此，當前豌豆SSR的標記數(shù)量比較少，極大限制了對豌豆分子水平的認識，因此開發(fā)出更多更有效的豌豆SSR分子標記很重要。

當前，利用近緣物種之間的跨種擴增，開發(fā)具有通用性的SSR引物是一種成本低廉而且簡便易行的有效途徑。P.K.Sharma等［12］研究發(fā)現(xiàn)98對水稻SSR引物和20對甘蔗EST-SSR引物在竹子中的通用性比率分別為44.9%和75%；鐘敏等［13］檢測表明1 205對綠豆SSR引物在豇豆、小豆和飯豆中的通用性比率分別為50.0%、73.3%和81.6%。因此，SSR引物在物種之間具有通用性，并且這些通用性引物可在近緣物種甚至遠緣物種之間進行比較基因組學的研究［14］。

豆科植物的不同物種基因組之間存在大量保守區(qū)域，而且基因組的相似程度較高［15］。因此，本研究擬從豌豆的近緣物種——豇豆的基因組SSR引物中篩選出在豌豆基因組中具有通用性和多態(tài)性較好的SSR引物，并嘗試應用于豌豆品種資源的遺傳多樣性和遺傳關系分析，以期為開展豌豆比較基因組學以及分子輔助植物育種等研究提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

16份樣品材料均由湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心提供，其中包括11個豌豆品種和5個豇豆品種（表1）。

1.2 基因組總DNA提取

采用改進的CTAB法從豌豆和豇豆嫩葉中提取基因組總DNA，采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA［16］。

1.3 PCR擴增以及產物檢測

根據P.Xu發(fā)布的豇豆SSR引物信息［17］，從豇豆全基因組上隨機選取13對SSR引物，引物序列及位置信息詳見表2。

PCR反應在Mastercycler gradient PCR儀上進行，反應體系為每支20 μL，包括2 μL 10×PCR Buffer含Mg2+，0.4 μL dNTP（10 mM），0.1μL Taq DNA Polymerase（5U/μL），2.5μL模板DNA（40 ng/μL），1 μL正向引物（20 pM/μL），1 μL反向引物（20 pM/μL），余下體積用ddH2O補充。引物信息見表2。

PCR反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸90 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。先用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物擴增效果，再用8%PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）進行檢測。電泳完畢，采用硝酸銀法染色，然后照相記錄。

1.4 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計SSR擴增產物數(shù)據，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”。擴增產物片段大小以50 bp DNA ladder作為分子量參考來讀取，所記錄的原始數(shù)據匯總到Excel表格中，形成數(shù)據矩陣。利用NTSYS-pc軟件［18］進行UPGMA（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，非加權組平均法）聚類分析。采用POPGENE軟件計算遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和Shannon指數(shù)。

表1 供試的16份樣品材料Tab.1Information of the 16 experimental samples

表2 13對豇豆SSR引物信息表Tab.2Information of the 13 SSR primer pairs of cowpea

2 結果與分析

2.1 豇豆基因組SSR引物在豌豆中的通用性分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測分析表明（圖1）：13對豇豆基因組SSR引物中有8對（CLM0389、CLM0573、CLM0269、CLM0443、CLM0311、CLM0158、CLM1173、CLM0022）在豌豆材料中能夠擴增出DNA條帶，因此，豇豆SSR引物在豌豆中的可轉移性比率達61.5%。其他5對豇豆SSR引物擴增后無擴增產物。進一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明，在8對可跨種擴增的SSR引物中有5對為多態(tài)性引物，分別是CLM0573、CLM0269、CLM0158、CLM1173和CLM0022。

圖1 豇豆SSR引物CLM0573在豌豆和豇豆材料中擴增產物的電泳圖（2%瓊脂糖凝膠電泳）Fig.1Profile of cowpea SSR primer pairs CLM0573 amplified in pea and cowpea(2%agarose gel electrophoresis)

在不同的豌豆品種中，可以有效擴增的豇豆SSR引物數(shù)量表現(xiàn)出較大的差異（表3）。其中，在W-6（豌豆6號）、W-7（豌豆7號）、W-8（豌豆8號）和W-9（豌豆9號）這4個豌豆品種材料中都有8對引物可以擴增，比率為61.5%。與之相比較而言，在W-2（豌豆2號）和W-3（豌豆3號）品種中有效擴增的SSR引物較少，比率為30.8%。其余5個豌豆品種，有3個豌豆品種（豌豆4號、豌豆15號和大菜豌）的有效擴增比率為38.5%，2個（豌豆5號和胖豌豆）有效擴增比率為46.2%。由此可見，不同豌豆品種的遺傳背景有差異，因而檢測得到SSR位點的數(shù)量和位置也表現(xiàn)出差別，說明篩選獲得的可轉移性豇豆SSR引物可以對豌豆品種進行有效區(qū)分。

2.2 遺傳多樣性分析

通過遺傳多樣性分析表明，供試的豌豆品種群具有中等水平的遺傳多樣性。從表4中可以看到，有5對多態(tài)性SSR引物在11份豌豆材料中檢測到的平均等位基因數(shù)為2.00，有效等位基因數(shù)在1.22～2.00之間，其平均值為1.64，Shannon指數(shù)在0.33～0.69之間，其平均值為0.55。而5對多態(tài)性SSR引物在5種豇豆材料中檢測平均等位基因數(shù)為2.00，有效等位基因數(shù)在1.00～2.00之間，其平均值為1.80，Shannon指數(shù)變異范圍為0.00～0.69，其平均值為0.53。

2.3 基于SSR標記的聚類分析

基于多態(tài)性SSR引物的UPGMA聚類分析表明，豇豆品種群和豌豆品種群可以被有效區(qū)別，而且豇豆品種群和豌豆品種群又可以被劃分為若干亞群（圖2）。在遺傳相似系數(shù)SM（Simple Match Index，SM）值0.61處，16種材料形成兩大分支：I為豇豆品種群，II為豌豆品種群。

豇豆品種群中，除A-8（株洲三尺豇）與A-27（金束鹿領先一號）無法區(qū)分外，其余3份豇豆材料能區(qū)分開。

表4 基于5對多態(tài)性豇豆通用SSR引物在豌豆和豇豆樣品中的遺傳參數(shù)分析Tab.4Genetic parametes of the pea samples and the cowpea samples based on ploymorphic and transferable cowpea SSR markers

在豌豆的兩個品種亞群中，品種亞群IIa包括W-6（豌豆6號，英國）、W-8（豌豆8號，英國）、W-9（豌豆9號，非洲）和W-7（豌豆7號，英國），品種亞群IIb包括W-2（豌豆2號，美國）、W-3（豌豆3號，美國）、W-4（豌豆4號，美國）、W-5（豌豆5號，美國）、W-15（豌豆15號，美國）、W-17（大胖豌，中國）和W-18（菜豌豆，中國）。品種亞群IIa中除W-9來源于非洲，W-6、W-7、W-8都為英國來源的品種；品種亞群IIb中除W-17和W-18外，W-2、W-3、W-4、W-5、W-15均來源于美國。由此可見，豌豆品種群可分為兩個亞群，聚類結果與其地理來源基本一致。

圖2 基于5對多態(tài)性豇豆通用SSR引物的豌豆和豇豆材料UPGMA聚類分析圖Fig.2UPGMA cluster of the pea samples and the cowpea samples based on ploymorphic and transferable cowpea SSR markers

3 討論

3.1 豇豆基因組SSR引物在豌豆中的通用性

SSR引物的通用性，在一定程度上取決于物種進化過程中的穩(wěn)定性和近緣SSR引物序列的保守性，一般而言，物種間親緣關系越近通用性就越高［19］。G.G.Di等［20］選用了11對葡萄SSR引物，對3個葡萄栽培品種、14個原葉葡萄屬內的亞屬品種以及近緣爬山虎屬內的五葉地錦和真葡萄亞屬進行跨種擴增，其中在葡萄屬和五葉地錦中分別有10對和7對SSR引物成功擴增，揭示出葡萄SSR序列在葡萄屬內具有高度保守性。鐘敏等［13］分析了2 240對綠豆SSR引物在豇豆屬其他作物中的通用性，檢測出1 205對可跨種擴增的SSR引物，其中有603對SSR引物在豇豆中具有通用性，883對引物在小豆中具有通用性，有983對引物在飯豆中具有通用性；比較這些引物在豇豆、小豆和飯豆中的通用性，可發(fā)現(xiàn)在飯豆中的通用率最高，為81.6%，說明不同類型的綠豆SSR引物在豇豆屬其他作物中的可轉移比率存在差異。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)豇豆基因組SSR引物在豌豆中具有較高的通用性。從13對豇豆SSR引物中篩選出8對有效擴增引物可用于豌豆，可轉移比率為61.5%，其中有5對SSR引物在豌豆中表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比率為38.5%。此外，有5對豇豆SSR引物在豌豆基因組中沒有擴增產物，推測可能是這5對豇豆SSR引物在豌豆基因組中沒有相應的基因位點。

3.2 豌豆與豇豆的遺傳關系聚類分析

本研究中篩選得到的5對多態(tài)性豇豆SSR引物，成功應用于豌豆品種資源的遺傳多樣性分析，能有效區(qū)分不同的品種材料，并通過聚類分析產生的樹狀圖揭示了豌豆與豇豆之間以及其內部各個品種之間的遺傳關系?；谶@5對多態(tài)性SSR引物的UPGMA聚類分析，能將豇豆品種群和豌豆品種群明顯區(qū)分開來，而且在豇豆品種群和豌豆品種群內又可以劃分為若干亞群（圖2）。

值得一提的是，在豌豆品種群內，兩個豌豆品種亞群的聚類結果與其地理來源基本一致。究其原因，可能與豌豆品種在不同地理生態(tài)環(huán)境下的區(qū)域進化和人工選擇相關。宗緒曉等［21］對豌豆群體進行了遺傳結構和主成分分析，研究結果表明，國內外豌豆資源形成3個差異顯著的基因庫，并且這3個基因庫與其地理生態(tài)環(huán)境相關性十分明顯。另外，在蠶豆和小麥等農作物的遺傳多樣性研究過程中也發(fā)現(xiàn)了同一個栽培品種資源在不同的地區(qū)也形成了不同的基因庫，這可能是物種的不同來源形成地理隔離造成的［22-23］。

綜上所述，對豌豆基因組信息的了解還很有限，利用同屬或其相近物種的SSR引物來了解豌豆遺傳信息，不失為一條經濟便捷的方式。筆者將豇豆SSR引物導入到豌豆基因組中，篩選出通用性較好的SSR引物，成功應用于豌豆的遺傳多樣性和遺傳關系分析，能進行群體和個體區(qū)分。研究結果將有助于開展豌豆種質資源的遺傳多樣性、親緣關系鑒定、基因發(fā)掘與定位、比較基因組學以及分子輔助植物育種等研究。

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（責任編輯：陳曠）

Analysis and Application of Transferable SSR Molecular Markers from Cowpea（Vigna unguiculata）to Pea（Pisum sativum）

PAN Lei1，2，XU Yafang1，2，GUO Rui1，2，LI Jianan1，2，HU Zhihui1，2，CHEN Chanyou*1，2
（1.Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plant，Wuhan 430056，Hubei，China；2.School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Aimed to screen out transferable SSR（simple sequence repeat）molecular markers from cowpea（Vigna unguiculata）to pea（Pisum sativum）.Using thirteen cowpea SSR primer pairs，eight primer pairs were successfully cross-amplified in pea.Five of the eight primer pairs exhibited polymorphism，and then to study the genetic variation of eleven pea cultivars and five cowpea culti?vars.Results showed that genetic parameters of the average number of alleles，the average effective number of alleles and the average Shannon′s index are 2.00，1.64，0.55 in the pea cultivar group，and 2.00，1.80，0.53 in the cowpea cultivar group，respectively.These indicated that a moderate level of genetic diversity was revealed in the two cultivar groups.In addtion，UPGMA clustering showed that the pea cultivar group and the cowpea cultivar group clustered into their own branches，respectively.Within each group，most of the samples can be distinguished from each other.Especial?ly，within the pea cultivar group，all the samples can be divided into two subgroups，which are con?sistent with their geographical origin.

Pisum sativum；Vigna unguiculata；simple sequence repeat(SSR)；transferability

S643.3；S643.4

：A

：1673-0143（2014）05-0080-07

2014-08-22

湖北省自然科學基金項目（2013CBF213）；武漢市科技攻關項目（2013021001010478）；武漢市科技局青年晨光計劃項目（2013071004010476）；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心開放基金項目（2014-10）；江漢大學高層次人才啟動經費項目（2012027）

潘磊（1980—），男，講師，博士，研究方向：植物種質資源與分子育種。

*通訊作者：陳禪友（1963—），男，教授，博士，研究方向：植物遺傳與育種。E-mail：ccy@jhun.edu.cn