薄 海，果鳳春，段富強(qiáng)，彭 朋，秦永生

論著

高原習(xí)服過程淋巴細(xì)胞線粒體DNA含量及氧化損傷變化規(guī)律

薄 海1,2，果鳳春3，段富強(qiáng)4，彭 朋1，秦永生1

目的觀察世居平原男性青年高原習(xí)服各時(shí)程淋巴細(xì)胞線粒體能量代謝、線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)及其氧化損傷的動態(tài)變化規(guī)律。方法27名世居平原武警新兵急進(jìn)高原，分別在移居高原3、7、90 d檢測淋巴細(xì)胞線粒體膜電位、mtDNA中8-oxodG含量、mtDNA拷貝數(shù)和PGC-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，膜電位顯著降低(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷貝數(shù)和PGC-1α表達(dá)顯著升高(P<0.05)；移居高原90 d，mtDNA拷貝數(shù)和PGC-1α表達(dá)顯著降低(P<0.05)。移居高原90 d與移居高原7 d比較，膜電位顯著升高(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷貝數(shù)和PGC-1α表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論高原習(xí)服初期淋巴細(xì)胞能量重構(gòu)主要依賴于線粒體數(shù)量增加，而在高原習(xí)服后期主要依賴于單個線粒體健康程度及能量代謝水平提高。

高原習(xí)服；淋巴細(xì)胞；線粒體DNA；拷貝數(shù)；氧化損傷

高原習(xí)服，是人類從低海拔地區(qū)進(jìn)入高海拔環(huán)境后，機(jī)體為適應(yīng)低氧環(huán)境發(fā)生的一系列提高低氧耐受能力的適應(yīng)性變化。前期研究發(fā)現(xiàn)，久居平原武警新兵急進(jìn)高原7 d，血氧飽和度即恢復(fù)至久居高原人群水平；移居高原90 d，心輸出量明顯高于急進(jìn)高原7 d[1]。這表明在高原習(xí)服過程中，機(jī)體氧攝取和運(yùn)輸發(fā)生了明顯的適應(yīng)性變化。線粒體是細(xì)胞主要氧利用和能量合成場所。研究表明，急性高原低氧暴露抑制淋巴細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ活性，降低線粒體呼吸速率[2]。羅勇軍等[3]報(bào)道，平原漢族人群移居高原1年，白細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)顯著高于平原人群。因此，可以認(rèn)為線粒體數(shù)量和質(zhì)量適應(yīng)性變化是高原低氧習(xí)服的重要環(huán)節(jié)。本研究擬觀察世居平原男性青年高原習(xí)服各時(shí)程線粒體能量代謝、線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)及其氧化損傷的動態(tài)變化規(guī)律，并探討其生物學(xué)意義。

1 對象和方法

1.1 對象 采取整群抽樣法，選取同年招收的武警新兵中無進(jìn)駐高原經(jīng)歷的青年男性27名為受試者，年齡(18.35±0.85)歲，身高(172.51±5.15) cm，體重(60.74±7.01) kg。所有受試者同批次由平原地區(qū)(成都，海拔約500 m)乘飛機(jī)直接到達(dá)高原地區(qū)(拉薩，海拔約3700 m)。

1.2 方法 參照《高原習(xí)服評價(jià)指標(biāo)與方法》(國家軍用標(biāo)準(zhǔn)GJB4301-2002)劃分的習(xí)服進(jìn)程[4]，分別在平原階段、急進(jìn)高原階段(3 d)、高原初步習(xí)服階段(7 d)和高原基本習(xí)服階段(90 d)，抽取空腹靜脈血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 淋巴細(xì)胞分離 抗凝血用PBS等體積稀釋，緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，800 g離心20 min，取淋巴細(xì)胞層，PBS洗滌兩次，1000 g離心20 min，棄上清，收集淋巴細(xì)胞。留取部分細(xì)胞測定線粒體膜電位，其余細(xì)胞-20 ℃凍存。

1.4 淋巴細(xì)胞線粒體膜電位測定 采用JC-1熒光探針檢測淋巴細(xì)胞線粒體膜電位[5]。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行(碧云天生物技術(shù)研究所)，將細(xì)胞加入0.9 ml JC-1染色工作液，加入3 μmol洋地黃皂甙透膜3 min。37 ℃避光水浴10 min。加入3 μmol蘋果酸和8 μmol谷氨酸啟動線粒體呼吸，熒光分光光度計(jì)測定紅色熒光(激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm)與綠色熒光(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm)。計(jì)算紅色熒光數(shù)值/綠色熒光數(shù)值表示線粒體膜電位。

1.5 淋巴細(xì)胞mtDNA中8-氧鳥嘌呤脫氧核苷(8-oxodG)含量測定 按照試劑盒(Biovision)說明書提取并純化mtDNA。高效液相色譜法檢測mtDNA中8-oxodG含量。色譜柱采用粒徑為4 μm的C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，流動相采用30 mmol氫氧化鈉，10 mmol醋酸，25 mM醋酸鈉，12.5 mM檸檬酸，6%甲醇，流速為0.8 ml/min，檢測波長260 nm。8-oxodG標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，上述條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品中8-oxodG含量(μg/ml)。

1.6 淋巴細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)測定 按照試劑盒(Biovision)說明書提取并純化細(xì)胞總DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測線粒體基因CytB及核基因18s rRNA的含量。引物序列：CytB上游，5′-CGGCTGACTAATCCGATACC-3′；下游，5′-TGGGAGTACATAGCCCATGA-3′。18s rRNA上游，5′-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3′；下游：5′-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3′。RT-PCR采用SYB-R Green master mix 試劑盒(ABI)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃/5 s，58 ℃/30 s，循環(huán)40次。計(jì)算CytB與18 s rRNA含量的比值確定淋巴細(xì)胞mtDNA 的相對拷貝數(shù)。

1.7 過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(PGC-1α)蛋白表達(dá) Western blot法檢測淋巴細(xì)胞PGC-1α蛋白表達(dá)量，以β-tubulin作為內(nèi)參。垂直電泳儀上用10 μg提取蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移致PVDF膜上。一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再以1∶1000辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描定量各條帶相對灰度值。以平原組條帶灰度值為100%，其灰度值與平原組條帶灰度值的比值，即為其相對表達(dá)量(%)。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴細(xì)胞線粒體膜電位及mtDNA中8-oxodG含量變化 與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著升高(P<0.05)。與移居高原3 d比較，移居高原7 d和90 d，線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著降低(P<0.05)。與移居高原7 d比較，移居高原90 d，線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2 淋巴細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)的變化 與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，移居高原90 d，mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。移居高原90 d與移居高原3 d、7 d比較，mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖1 高原習(xí)服進(jìn)程中淋巴細(xì)胞線粒體膜電位及mtDNA中8-oxodG含量的變化

圖2 高原習(xí)服進(jìn)程中淋巴細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

線粒體氧化應(yīng)激是低氧損傷的重要機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧暴露顯著增加線粒體電子漏，提高線粒體ROS生成速率[6]。mtDNA定位緊鄰呼吸鏈ROS生成位點(diǎn)，且缺乏組蛋白和修復(fù)酶等保護(hù)機(jī)制，極易受到ROS攻擊造成氧化損傷，mtDNA堿基被氧化修飾為8-oxodG。研究表明，如果DNA中8-oxodG不能有效清除，在復(fù)制過程中可引起G∶C-T∶A顛換突變；也可導(dǎo)致RNA聚合酶滑脫，在轉(zhuǎn)錄本中形成移碼突變[7]。Ballinger等[8]發(fā)現(xiàn)，用H2O2孵育人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可導(dǎo)致mtDNA氧化損傷，并伴隨由mtDNA編碼的13個復(fù)合體亞基mRNA表達(dá)均降低，線粒體氧化磷酸化效率降低。以上表明，mtDNA氧化損傷程度與單個線粒體健康程度及能量代謝水平呈負(fù)相關(guān)。

本研究中，久居平原武警新兵移居高原3 d和7 d后，mtDNA中8-oxodG含量明顯高于平原階段，但7 d較3 d mtDNA氧化損傷有所降低。Ferro等[9]也發(fā)現(xiàn)，貧血造成的低氧血癥可引起淋巴細(xì)胞ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致mtDNA中8-oxodG含量增加，線粒體呼吸速率降低。Colleoni等[10]報(bào)道，人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞低氧暴露4 d，mtDNA編碼的復(fù)合體Ⅰ亞基ND1、復(fù)合體Ⅳ亞基COX2以及ATP合成酶亞基ATP6的mRNA表達(dá)顯著降低。筆者利用細(xì)胞透膜的方法檢測了淋巴細(xì)胞內(nèi)線粒體整體膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體整體能量輸出水平在移居高原3 d和7 d時(shí)明顯低于平原階段。總之，急進(jìn)高原誘發(fā)的mtDNA氧化損傷是線粒體功能損傷的一個重要原因。

線粒體整體能量輸出水平受到單個線粒體能量代謝水平和線粒體數(shù)量的共同影響。為了代償?shù)脱跽T導(dǎo)的線粒體氧化損傷和能量代謝障礙，機(jī)體啟動線粒體生物合成，以促進(jìn)mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，增加mtDNA拷貝數(shù)和線粒體數(shù)量。PGC-1α是調(diào)控線粒體生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。Gutsaeva等[11]發(fā)現(xiàn)，短暫缺血可提高線粒體ROS產(chǎn)生，繼而通過活化p38 MAPK刺激PGC-1α介導(dǎo)的線粒體生物合成。本研究中，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷貝數(shù)和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯高于平原階段，而線粒體整體膜電位雖在第7天有所恢復(fù)，但仍低于平原階段。結(jié)果表明，在高原低氧習(xí)服初步階段，急性低氧活化PGC-1α通路增加線粒體數(shù)量，但mtDNA氧化損傷造成新生線粒體能量代謝障礙，而ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)一步加劇氧化損傷，形成惡性循環(huán)，因而無法完全恢復(fù)受損的能量供應(yīng)。

本研究中，移居高原90 d，mtDNA氧化損傷較7 d進(jìn)一步降低，mtDNA拷貝數(shù)及PGC-1α蛋白表達(dá)低于平原階段，而線粒體膜電位基本恢復(fù)至平原水平。Levett等[12]也發(fā)現(xiàn)平原人群移居高原19 d線粒體生物合成無明顯變化，而66 d時(shí)線粒體生物合成明顯降低。Gamboa等[13]證明，慢性低氧通過活化低氧誘導(dǎo)因子抑制PGC-1α介導(dǎo)的線粒體生物合成，但促進(jìn)線粒體重分布于肌膜下，以提高毛細(xì)血管中氧向線粒體的擴(kuò)散效率。本研究前期發(fā)現(xiàn)，慢性低氧可通過上調(diào)SIRT3提高線粒體呼吸速率，并增加線粒體抗氧化酶MnSOD和GPx活性[14]。筆者推測，隨著低氧暴露時(shí)間延長，線粒體發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，包括抗氧化及DNA修復(fù)能力提高，mtDNA氧化損傷降低，單個線粒體健康程度及能量代謝水平升高，足以恢復(fù)細(xì)胞能量供應(yīng)，因而減少了對線粒體數(shù)量的依賴性，這也符合生物節(jié)省化原則。

高原習(xí)服的一個重要因素是提高線粒體氧利用和能量輸出效率，維持機(jī)體在低氧環(huán)境中的工作能力。本研究結(jié)果表明，高原低氧習(xí)服初期，淋巴細(xì)胞能量重構(gòu)主要依賴于線粒體生物合成增加以提高線粒體數(shù)量，但不能完全恢復(fù)能量代謝水平；而在習(xí)服后期，淋巴細(xì)胞能量重構(gòu)主要依賴于抑制mtDNA氧化損傷，提高單個線粒體健康程度及能量代謝水平，實(shí)現(xiàn)能量供應(yīng)的完全習(xí)服。這為高原習(xí)服的評價(jià)及干預(yù)策略的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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(2014-01-26收稿 2014-05-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

ChangesincontentsofleukocytemitochondrialDNAandoxidativedamageduringacclimatizationtohighland

BO Hai1,2, GUO Fengchun3, DUAN Fuqiang4, PENG Peng1, and QIN Yongsheng1.

1.Department of Military Training Medicine; 2.Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury; 3.Department of Logistics Research, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China; 4.Department of Health, Tibet Autonomous Regional Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Lhasa 850000, China

ObjectiveTo study the changes in mitochondrial bioenergetics, mitochondrial DNA (mtDNA) and oxidative damage in leukocytes during acclimatization to highland hypoxia.MethodsTwenty-seven lowlanders quickly entered plateau. Leukocyte mitochondrial membrane potential, 8-oxodG in mtDNA, mtDNA copies and PGC-1α protein expression were measured in plain and plateau at 3 d，7 d，90 d after entry.ResultsAs compared with plain group, membrane potential was significantly decreased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly increased at 3 d and 7 d (P<0.05). And at 90 d, mtDNA copies and PGC-1α expression were significantly decreased (P<0.05). As compared with 7 d group, membrane potential was significantly increased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly decreased at 90 d (P<0.05).ConclusionsIn the early phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on increased mitochondrial content. In the later phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on elevated level of single mitochondrial health and energy metabolism.

acclimatization to high-altitude; leukocytes; mitochondrial DNA; copy number; oxidative stress

薄 海，博士，講師，E-mail：bohaixd@126.com

300309天津，武警后勤學(xué)院：1.軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室，2.天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.后勤工作研究所；4.850000拉薩，武警西藏總隊(duì)后勤部衛(wèi)生處

秦永生，E-mail：qinyongshengwj@126.com

R446.11