姜 毅，韓志海，王曉陽，方庭正，黃 燕，段蘊鈾

硫化氫吸入干預大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷中的氧化應激

姜 毅1,2，韓志海3，王曉陽1，方庭正1，黃 燕1，段蘊鈾1

目的探討吸入硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)干預大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷的氧化應激反應機制。方法24只雄性SD大鼠隨機分成對照組、H2S組、煙霧組、煙霧+H2S組，每組6只。復制大鼠棉花煙霧吸入性損傷模型，在煙霧吸入或模擬煙霧吸入后，H2S組、煙霧+H2S組大鼠予以持續(xù)吸入H2S 80 ppm+30%氧氣6 h，對照組、煙霧組予以吸入30%氧氣6 h，ELISA法檢測肺組織勻漿中MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度，免疫組化檢測肺組織NF-κB p65并進行半定量分析，熒光定量PCR法行肺組織iNOS mRNA定量。結果煙霧組大鼠肺組織勻漿中MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度和肺組織中NF-κB p65的累積光密度、iNOS mRNA的相對表達量均明顯高于對照組，而煙霧+H2S組的上述指標較煙霧組均明顯降低，如肺組織勻漿中NF-κB p65濃度(8123.51±2095.33) pg/mlvs(13803.19±2196.37) pg/ml，P<0.001；肺組織中iNOS mRNA的相對表達量(1.04±0.24)vs(2.20±0.21)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；H2S組iNOS濃度、iNOS mRNA的相對表達量、NF-κB p65的累積光密度高于對照組，但MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度與對照組比較無明顯差別。結論吸入H2S的干預機制可能是吸入H2S可抑制NF-κB p65的激活，使iNOS mRNA的轉錄合成減少，從而減少iNOS、NO生成，減輕氧化應激反應和減輕大鼠肺損傷。

急性肺損傷；煙霧吸入性損傷；氧化應激；硫化氫

煙霧吸入性損傷主要發(fā)生在呼吸道和肺實質，嚴重者產(chǎn)生中毒性肺炎或肺水腫，可迅速進展為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS)，使救治難度加大，病死率增加[1]。在煙霧吸入性損傷的發(fā)病機制中，氧化應激占有很大比重。高溫煙霧中的很多成分是強氧化劑，并且炎性反應失控時大量的炎性反應細胞聚集在肺內，產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，也可誘導氧化應激損傷。

近十年來的研究發(fā)現(xiàn)，H2S具有抗氧化應激[2]、調節(jié)炎性反應[3]、舒張血管[4-7]、抗纖維化、參與調節(jié)內分泌及生殖系統(tǒng)功能等作用[8]。吸入H2S 80 ppm 6 h，在內毒素誘導的ALI小鼠模型中可抑制全身炎性反應，提高小鼠生存率[9, 10]；在過度通氣誘導的ALI小鼠模型中可抑制肺內炎性反應和肺泡上皮細胞凋亡而保護肺臟[11]。本課題前期實驗研究證實，大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷時氧化應激反應增強，本實驗經(jīng)預實驗后觀察吸入80 ppm H2S 6 h氣體對大鼠煙霧吸入性肺損傷時氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD大鼠共24只，體重150～250 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0004]提供，海軍總醫(yī)院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0012]飼養(yǎng)。遵守實驗動物條例處置動物，按照隨機化原則將動物分組，分為對照組、H2S組、煙霧組、煙霧+H2S組，每組6只。

1.2 大鼠煙霧吸入性損傷模型的復制及H2S的吸入 參照文獻[12-14]，本課題組已成功制作大鼠煙霧吸入性損傷模型，操作如下：大鼠2只分別置入吸煙瓶中，錫爐預熱至300 ℃恒溫，稱取2 g棉花放入錫爐內，立即蓋上集煙筒，啟動風扇，開始計時2 min，見大鼠足底皮膚逐漸出現(xiàn)櫻紅色至紫紅色，并有躁動、呼吸急促、張口呼吸，至出現(xiàn)呼吸深慢、張口喘鳴時或滿2 min時限時，予以停止吸煙，立即敞開吸煙瓶口，吸入空氣7 min，重復上述步驟3～5次，至大鼠吸入空氣7 min仍舊昏迷不醒時結束。4組大鼠均先后置于煙霧吸入裝置中給予上述類似處置，其中煙霧組、煙霧+H2S組給予煙霧輸入，對照組、H2S組無煙霧輸入；在煙霧吸入或模擬煙霧吸入后，4組大鼠均給予30%氧氣吸入6 h，但H2S組、煙霧+H2S組大鼠還同時予以吸入H2S 80 ppm 6 h。實驗中大鼠予以自由進食及飲水。

1.3 ELISA檢測 實驗結束后大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉致死。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測右肺下葉勻漿中一氧化氮(nitric oxide，NO)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、核轉錄因子-κB p65(nuclear factor-kappaB，NF-κB p65)濃度。比色法檢測右肺下葉肺組織勻漿中丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。ELISA試劑盒廠家為嘉美生物(Jiamay Biotech Co.Ltd)，按試劑盒說明操作。

1.4 右肺中葉肺組織NF-κB p65免疫組化檢測及半定量分析 右肺中葉4%多聚甲醛溶液浸泡72 h后常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度3 μm，60～65 ℃烤片4 h，脫蠟、水化、PBS緩沖液洗滌，高壓修復組織抗原，3%H2O2滅活過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加第一抗體Anti-NF-κB p65 antibody (abcam，ab16502) 50 μl，稀釋度1∶200，4 ℃孵育過夜，滴加復合二抗HRP-Polymer anti Mouse/Rabbit IgG(Maixin.Bio，KIT-5020)，室溫靜置20 min；DAB顯色，蘇木精復染，陰性對照以血清代替一抗。鏡檢陽性染色為黃色或棕黃色染色。應用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)進行半定量分析，每張玻片顯微鏡下隨機選擇5個高倍鏡視野(×1000)，以相同參數(shù)攝取圖像，IPP6.0軟件分析得出每個視野陽性染色的平均光密度(mean density)、積分光密度(integrated optical density，IOD)的總和即累積光密度(sum IOD)，計算出每個標本上述指標的均值，從而對染色濃度進行半定量分析。

1.5 熒光定量PCR方法檢測大鼠右肺上葉iNOS mRNA轉錄水平 目的基因iNOS的PCR檢測引物序列由嘉美生物設計合成，iNOS上下游引物分別是5′-ACACCGATTCCACTCAACTA-3′和5′-ACCACCTGTTAGTTCAAGCC-3′，擴增產(chǎn)物長度為159bp，內參為β-actin(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0918)。用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本中總RNA。取5 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。用HiFi-MMLVcDNA第1鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)進行反轉錄，用UltraSYBR Mixture(with Rox)(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0956)進行擴增，擴增程序為：95 ℃ 10 min，(95 ℃15 s+60 ℃ 60 s) 40個循環(huán)。用LightCycler-480II型熒光定量PCR儀測量，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

2 結 果

2.1 大鼠肺組織勻漿ELISA檢測結果 由表1可見，煙霧組大鼠肺組織勻漿中MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度較對照組均明顯升高(P<0.001)，煙霧+H2S組上述指標較煙霧組降低(P<0.001)。H2S組上述指標僅iNOS濃度高于對照組，其他指標與對照組比較無明顯差別，H2S組上述指標均低于煙霧組。

表1 各組大鼠肺組織中MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度檢測結果 ；n=6)

注：與煙霧組比較，①P<0.05；與對照組比較， ②P<0.05

2.2 大鼠體重和肺組織iNOSmRNA的相對表達量 由表2可見，各組大鼠體重沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，大鼠平均體重為(186.68±28.79) g，可以認為大鼠體重對各組間實驗結果沒有影響。煙霧組、煙霧+H2S組和H2S組大鼠肺組織iNOSmRNA的相對表達量較對照組明顯升高(P<0.001)，煙霧+H2S組和H2S組較煙霧組降低(P<0.001)。

2.3 大鼠肺組織iNOS的免疫組化分析結果 大鼠肺組織NF-κB p65的免疫組化染色結果見圖1。由表2可見，大鼠肺組織NF-κB p65的累積光密度(sum IOD)煙霧組較對照組高(P<0.001)；煙霧+H2S組和H2S組較煙霧組低(P<0.01)，但比對照組高(P<0.001)。大鼠肺組織NF-κB p65的平均光密度(mean density) H2S組、煙霧組、煙霧+H2S組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但均低于對照組(P<0.01)。

表2 各組大鼠體重、肺組織iNOS mRNA相對表達量、NF-κB p65累積吸光度和平均光密度的比較 ；n=6)

注：與煙霧組比較，①P<0.05；與對照組比較， ②P<0.05

圖1 肺組織NF-κB p65免疫組化染色鏡下觀察(×1000)

3 討 論

煙霧成分的復雜性決定了煙霧吸入性肺損傷的發(fā)病機制的復雜性，尤以氧化應激更為重要[15]。煙霧吸入可激活肺內巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞釋放出大量細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8等，從而激活NF-κB，其在胞漿中分解后的活性片段NF-κB p65進入細胞核，促進下游iNOS mRNA的轉錄，導致iNOS的合成增加，iNOS可分解精氨酸產(chǎn)生大量NO，可催化合成過氧化亞硝酸鹽，引起生物膜的脂質過氧化反應[16]。同時，煙霧中的NO、N2O、SO2、氧化性顆粒物均是強氧化劑，粒細胞受刺激30 s內即可釋放出大量的氧自由基，缺氧后吸氧治療也增加氧自由基的產(chǎn)生。氧自由基同樣可使生物膜發(fā)生脂質過氧化反應，破壞膜結構，激活炎性介質的合成，影響能量代謝，并使蛋白質變性而發(fā)生功能障礙。上述損傷性因素使肺泡-毛細血管通透性增高，血液中有形成分滲出到肺泡腔，形成肺水腫。此外, 煙霧吸入性肺損傷產(chǎn)生的活性氧可導致NO合成過量[17]，NO可使血管外漏、缺氧性肺血管收縮功能喪失[18]，同時使具有細胞毒性的活性氮(reactive nitrogen species，RNS)生成增加[19]，進一步加重肺損傷。既往本課題組的實驗研究已證實，大鼠棉花煙霧吸入后6 h即可出現(xiàn)典型的肺損傷表現(xiàn)，本實驗發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入后6 h大鼠肺組織中NF-κB p65濃度、NF-κB p65的累積光密度、iNOSmRNA的相對表達量、iNOS和NO濃度均增高，完全符合上述煙霧吸入后氧化應激反應的表現(xiàn)，即煙霧吸入后激活NF-κB，NF-κB p65濃度增加并進入細胞核，促進iNOS mRNA的轉錄增加，使iNOS表達增加和NO合成增多。同時，MDA作為自由基與生物膜多價不飽和脂肪酸發(fā)生反應而生成的過氧化物，其含量的同步升高也說明氧化應激反應加劇，脂質過氧化反應增強，組織損傷加重。

火災后煙霧吸入性肺損傷的早期救治尤為關鍵，從其發(fā)病機制可以看出，打斷氧化應激反應通路，抑制NF-κB的激活從而減少其下游產(chǎn)物的生成，從理論上看有可能減輕肺損傷。有研究表明，連續(xù)靜脈點滴低劑量精氨酸血管加壓素，抑制iNOS產(chǎn)生過量的NO，可明顯減輕燒傷和煙霧吸入導致的肺損傷[20]。

近些年的研究中，H2S一改既往“具有臭雞蛋氣味的神經(jīng)毒氣”形象，被稱為繼NO、CO之后的第3種氣體信號分子[21, 22]。動物實驗證實，靜脈點滴硫氫化鈉(NaHS)或吸入H2S氣體，在多種原因所致的肺損傷動物模型研究中具有抗氧化應激、抗炎性反應、抗凋亡、減輕肺損傷的作用[2, 9-11, 23]，但吸入H2S氣體對煙霧吸入性肺損傷的作用研究尚無報道。在脂多糖激活的離體巨噬細胞中，H2S可抑制NF-κB信號通路的激活，減少NO的產(chǎn)生，而起到抗氧化應激的作用[24]。因此，筆者設計實驗研究吸入H2S氣體對煙霧吸入性肺損傷的干預效果。

實驗發(fā)現(xiàn)，在煙霧吸入后立即予以吸入H2S 80 ppm 6 h，可明顯減輕大鼠的肺損傷，在大鼠肺組織中NF-κB p65濃度、NF-κB p65的累積光密度、iNOSmRNA的相對表達量、iNOS和NO濃度均明顯降低，MDA下降，提示吸入H2S減輕大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷的機制可能是吸入H2S抑制了NF-κB p65的激活，使iNOSmRNA的轉錄合成減少，減少了iNOS、NO的生成，從而減輕氧化應激反應，減輕了大鼠的肺損傷。大鼠肺組織NF-κB p65的平均光密度(mean density) 代表了切片上免疫組化陽性染色的深淺，但不能代表陽性染色的總量變化，因而無指示意義。

細胞類型、氧自由基的類型、NF-κB通路上眾多氧化應激敏感位點的狀態(tài)、上游的信號通路等因素的變化均可影響到NF-κB的激活，從而干預氧化應激反應的進程[25]，因此，NF-κB是細胞對氧化應激狀態(tài)極為敏感的核轉錄因子。H2S調節(jié)NF-κB蛋白活性的上游通路包括ERK通路[26,27]、p38-MAPK通路[28]、血紅蛋白加氧酶-1和熱休克蛋白70[24]等。近年來對H2S的作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，H2S信號轉導的蛋白質巰基化機制，即H2S通過與靶蛋白的半胱氨酸活性殘基結合，發(fā)生蛋白質巰基化反應，改變蛋白質的活性，可能是H2S作用機制的中心環(huán)節(jié)[29,30]。在本實驗的煙霧+H2S組，煙霧為外部刺激，吸入后作用在肺內巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞，釋放出大量細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等。同時，煙霧中的氧化劑也導致細胞內氧自由基明顯增加，上述因素可激活NF-κB通路，使iNOS的表達及NO濃度均顯著升高，并使細胞處于強氧化狀態(tài)。由于機體抗氧化調節(jié)不足以對抗氧化應激[31]，機體損傷加劇。在此基礎上，外源性H2S的吸入表現(xiàn)出抑制NF-κB通路的作用，使iNOS表達及NO合成減少，而減輕了大鼠的肺損傷。說明大鼠棉花煙霧吸入后立即吸入H2S 80 ppm 6 h可減輕大鼠的肺損傷，H2S的應用具有研究意義。

本實驗中H2S組MDA、NO、iNOS、NF-κB p65濃度與對照組比較無統(tǒng)計學差異，大鼠未見明顯的肺損傷，說明單純吸入80 ppm H2S 6 h對健康大鼠是相對安全的。本實驗充實了H2S吸入研究的應用范疇。H2S屬較強的還原劑，氣道吸入后可直接與氧化劑發(fā)生中和反應，它至少能與超氧陰離子、過氧化氫、超氧化氮及次氯酸4種氧自由基起反應[32, 33]，從而保護膜結構免受自由基損傷，這也是吸入H2S氣體治療煙霧吸入性肺損傷的便利條件，在以后的研究中可繼續(xù)探討。在本次實驗研究中，只設計了6 h的治療時間段的比較，缺乏長期動態(tài)效果的觀察。另外，H2S可激活ATP敏感鉀通道而舒張血管[6]，調節(jié)Fas/FasL死亡受體通路而減輕凋亡[34]，抑制神經(jīng)源性炎性反應，3種氣體信號分子相互作用等[35]，這些機制也可能在煙霧性肺損傷的治療中發(fā)揮作用，可進一步探討。

本研究揭示了吸入H2S 80 ppm 6 h減輕大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷的機制可能是吸入H2S抑制了NF-κB p65的激活，使iNOSmRNA的轉錄合成減少，減少了NO的生成，減輕氧化應激反應，從而減輕了大鼠的肺損傷。

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(2014-01-23收稿 2014-03-02修回)

(責任編輯 岳建華)

Inhaledhydrogensulfideinhibitsoxidativestressofcottonsmokeinhalation-inducedacutelunginjuryinrats

JIANG Yi1,2, HAN Zhihai3, WANG Xiaoyang1, FANG Tingzheng1, HUANG Yan1，and DUAN Yunyou1. 1. Department of Respiratory Medicine, Clinical Medical College of Navy, Second Military Medical University, Beijing 100048, China; 2. Political Department Clinic of Shenyang Military Area Command, Shenyang 110032, China; 3. Pulmonary and Critical Care Medicine of PLA Navy General Hospital, Beijing 100048, China

ObjectiveTo investigate the mechanisms of inhaled hydrogen sulfide inhibiting oxidative stress of cotton smoke inhalation-induced acute lung injury in rats.MethodsTwenty-four male SD rats were randomly allocated into control group, H2S group, smoke group and smoke+H2S group. The rat model of cotton smoke inhalation injury was established. After smoke inhalation or simulated smoke inhalation, rats inhaled H2S 80 ppm, 30% oxygen for 6 hours (H2S group and smoke+H2S group), or rats inhaled 30% oxygen for 6 hours (control group and smoke group). Then rats were mercy killed. In each group of rats we observed the concentration of NO，iNOS，NF-κB p65，MDA in homogenized lung tissue by ELISA，used the method of fluorescence quantitative PCR to detect the expression of iNOS mRNA in homogenized lung tissue, and immunohistochemically detected the relative expression of NF-κB p65 with Image Pro Plus 6.0 software.ResultsCompared with the control group, concentrations of MDA, NO, iNOS, NF-κB p65, relative expression of iNOS mRNA and sum IOD of NF-κB p65 in the smoke group rats’ homogenized lung tissue were significantly elevated, and those in the smoke+H2S group were relatively lower, for example, concentrations of NF-κB p65 were (8123.51±2095.33) pg/ml vs (13803.19±2196.37) pg/ml,P<0.001; relative expression of iNOS mRNA was (1.04±0.24)vs(2.20±0.21),P<0.001. Concentrations of iNOS, relative expression of iNOS mRNA and sum IOD of NF-κB p65 in the H2S group were higher than those in the control group, meanwhile concentrations of MDA, NO, NF-κB p65 in the H2S group were similar to those in the control group.ConclusionsThe mechanisms of inhaled 80 ppm hydrogen sulfide for 6 hours protecting against cottn smoke inhalation-induced ALI in rats potentially is inhaled hydrogen sulfide inhibiting the activation of NF-κB p65, so the expression of iNOS mRNA, iNOS and NO grow downwards and as a result, it relieves oxidative stress and reduces pathological damage to lung tissue.

acute lung injury；smoke inhalation injury；oxidative stress；hydrogen sulfide

全軍醫(yī)學科研“十二五”計劃課題(CWS11J180)

姜 毅，博士，主治醫(yī)師，E-mail：jiangyi1974@sohu.com

1. 100048北京，第二軍醫(yī)大學海軍臨床醫(yī)學院呼吸內科；2. 110032沈陽， 沈陽軍區(qū)政治部門診部；3. 100048北京，海軍總醫(yī)院呼吸內科

通迅作者：段蘊鈾，E-mail：duanyunyou@126.com

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