張艷超，李運(yùn)明，賈玉英，張新顏，顧建文

·高原醫(yī)學(xué)·

模擬高原缺氧對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及腦組織病理改變

張艷超，李運(yùn)明，賈玉英，張新顏，顧建文

目的 觀察不同海拔高度對(duì)大鼠低壓缺氧腦損傷的空間記憶的影響及腦組織病理改變。方法 120只Wistar大鼠，分為模擬海拔4000 m(n=30)、6000 m(n=30)、8000 m(n=30)及平原組(海拔500 m，n=30)，利用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙模擬相應(yīng)海拔高度，各組大鼠分別在各自模擬海拔高度艙內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)3 d，觀察大鼠生存狀態(tài)；3 d后從艙內(nèi)取出大鼠，各組隨機(jī)抽取8只大鼠，在艙外利用Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)，對(duì)大鼠進(jìn)行尋找隱藏平臺(tái)的平均逃避潛伏期(MEL)測(cè)試；同時(shí)，各組從剩余大鼠中隨機(jī)抽取8只，從艙內(nèi)取出后立即處死，斷頭取腦，采用干/濕比重法測(cè)定各組大鼠腦組織含水量的變化；采用蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察各組大鼠腦組織病理變化。結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各模擬高原組MEL較平原組增加；不同高原組間比較，隨海拔升高，MEL延長(zhǎng)，差異顯著(P<0.01)。各模擬高原組大鼠腦組織含水量均較平原組顯著增加(P<0.05)，各高原組間比較，隨海拔升高，腦組織含水量逐步上升，差異明顯(P<0.05)；各高原缺氧組大鼠腦組織病理切片可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞和周圍血管水腫，且隨海拔升高，水腫程度加重。結(jié)論 高原低壓缺氧環(huán)境可導(dǎo)致大鼠腦水腫，進(jìn)而造成大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

高原；缺氧；腦水腫；學(xué)習(xí)記憶

隨著國(guó)家對(duì)西部大開(kāi)發(fā)政策的實(shí)施，平原人在高原地區(qū)的生活、工作等活動(dòng)日益廣泛。高原地勢(shì)高，空氣稀薄，當(dāng)人們從平原進(jìn)入高原地區(qū)時(shí)，伴隨著機(jī)體攝氧不足和組織氧供的減少，大腦明顯受損[1]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致高原腦水腫。學(xué)習(xí)記憶功能是大腦最重要的高級(jí)神經(jīng)功能之一，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合，長(zhǎng)期暴露在低壓缺氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性疾病，導(dǎo)致記憶障礙[2]。本研究采用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙模擬不同海拔高度制作高原缺氧腦損傷模型，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行觀察，取腦組織做病理切片觀察病理改變，探討模擬高原缺氧腦水腫與大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康Wistar成年大鼠120只[四川大學(xué)動(dòng)物房提供，使用許可證SYXK(川2009-045)]，雄性，體重(196.5±5.9)g。按大鼠體重編號(hào)后，采用SPSS軟件產(chǎn)生的完全隨機(jī)數(shù)字分為：4000 m、6000 m、8000 m 3個(gè)海拔高原組(n=30)，以及平原組(成都地區(qū)海拔約500 m，n=30)。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司，型號(hào)：FLYDWC50-1A)；Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號(hào)XMT614)；萬(wàn)分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：BSA223S]；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；切片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模擬高原低壓低氧環(huán)境 將各組大鼠置于低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，分別模擬海拔4000 m、6000 m、8000 m高原環(huán)境，72 h不間斷連續(xù)減壓。艙內(nèi)溫度控制在25 ℃左右，期間大鼠自由攝食及飲水。平原對(duì)照組大鼠于艙外(成都地區(qū)海拔約500 m)同時(shí)飼養(yǎng)。 觀察各組大鼠在此期間的生存狀態(tài)。

1.2.2 空間記憶功能測(cè)試 缺氧72 h后從艙內(nèi)取出大鼠，各組按SPSS軟件產(chǎn)生的完全隨機(jī)數(shù)字抽取8只，利用Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。先行1 d適應(yīng)訓(xùn)練，將大鼠放入無(wú)平臺(tái)的水池中游泳2 min，使其熟悉水池環(huán)境及適應(yīng)水溫，從第2 d開(kāi)始，進(jìn)行為期3 d的尋找水下隱匿平臺(tái)訓(xùn)練，水池平均分為4個(gè)象限，右上象限為一象限，逆時(shí)針?lè)较蛞来螢榈诙?、三、四象限。水池?nèi)放入清水(25±1)℃，平臺(tái)置于水下1 cm處。本次實(shí)驗(yàn)中將平臺(tái)放置于第一象限中部，將每只大鼠依次從一、二、三、四象限將大鼠面向桶壁放入水池，大鼠入水后尋找隱匿平臺(tái)并在平臺(tái)上停留5 s為該象限的逃避潛伏期(MEL)，然后開(kāi)始下一象限實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的MEL及行程。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每個(gè)象限每天只用一次，每只大鼠每天4個(gè)象限的MEL平均值記錄為當(dāng)天的平均逃避潛伏期。

1.2.3 腦組織切片的制備及含水量測(cè)定 各組模擬不同海拔高度飼養(yǎng)72 h后，各組按SPSS軟件產(chǎn)生的完全隨機(jī)數(shù)字抽取8只大鼠，從艙內(nèi)取出，立即處死，并快速斷頭取腦，矢狀位對(duì)稱切開(kāi)全腦，去除小腦及腦干。切取右側(cè)腦組織標(biāo)本，常規(guī)固定、石蠟包埋，4 μm切片，裱于經(jīng)多聚賴氨酸包被的清潔載玻片上，常規(guī)脫蠟、復(fù)水、PBS液洗滌，HE染色。取剩余左腦組織約0.7 g，準(zhǔn)確稱重后，放入恒溫烘干箱100 ℃烘烤24 h至恒重后，稱取干腦重(精確到0.01 g)，按Elliott公式計(jì)算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物生存狀態(tài)觀察 各高原組均出現(xiàn)呼吸節(jié)律變化，表現(xiàn)為短暫的呼吸暫停，精神萎靡、行動(dòng)遲緩、食欲差。3個(gè)高原組均發(fā)生了呼吸驟停、四肢抽搐及死亡，并且隨著海拔的升高,上述癥狀逐步加重。平原組未發(fā)現(xiàn)呼吸驟停、四肢抽搐及死亡等情況。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠異常表現(xiàn)情況[n=30，例(%)]

注：與平原組比較，①P<0.01；與4000 m組比較，②P<0.01；與6000 m組比較，③P<0.01

2.2 空間記憶功能測(cè)試 Morris水迷宮測(cè)試中，第2～3 d與第1 d相比，各組大鼠尋找隱藏平臺(tái)的MEL均縮短(P<0.01)；相同時(shí)間點(diǎn)，各高原組與平原組相比，MEL增加(P<0.01)，并隨海拔升高，MEL延長(zhǎng)(P<0.01，表2)，大鼠尋找逃逸平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)路線增加(圖1)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮MEL比較(n=8)

注：與第1 d比較，①P<0.01；與平原組比較，②P<0.01

2.3 腦組織病理學(xué)改變 大體觀察：各高原組均可見(jiàn)腦皮層彌漫充血、腦水腫；鏡下觀察，高倍鏡下，高原組均發(fā)現(xiàn)水腫神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞及血管周圍間隙增大，且隨海拔升高，大腦毛細(xì)血管和神經(jīng)細(xì)胞水腫程度逐漸加重。而平原組未見(jiàn)腦水腫，結(jié)構(gòu)完整。見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠腦含水量測(cè)定 各高原組腦含水量較平原組顯著增高(P<0.05)，且隨海拔升高腦含水量增加(P<0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠腦含水量比較

3 討論

學(xué)習(xí)記憶功能是大腦最重要的高級(jí)神經(jīng)功能之一，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合，高原地區(qū)隨著海拔升高，大氣壓變低，氧含量減少，溫度下降，濕度下降，紫外線輻射增加，可導(dǎo)致不同程度的顱腦損傷，從而引起學(xué)習(xí)記憶功能下降[3]，長(zhǎng)期暴露在低壓缺氧環(huán)境會(huì)引起氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性疾病，導(dǎo)致記憶障礙[4-5]。研究表明，大腦損傷后，近期記憶中的情節(jié)、記憶的過(guò)程與空間位置的學(xué)習(xí)都受到影響，大腦損傷將造成順行性遺忘癥[6]。

本研究Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，高原組尋找隱藏平臺(tái)的行程和時(shí)間明顯長(zhǎng)于平原組，提示缺氧對(duì)分辨學(xué)習(xí)、防御條件反應(yīng)的保持以及空間學(xué)習(xí)能力均有破壞，從而降低動(dòng)物或患者學(xué)習(xí)新事物和新技巧的能力。本研究結(jié)果表明，隨著海拔升高，大鼠尋找隱藏平臺(tái)的MEL和行程增加，提示隨著海拔升高，大鼠空間記憶功能下降，這與國(guó)外研究者結(jié)論一致[7-8]。

低壓缺氧致腦損傷后可導(dǎo)致腦水腫，造成顱內(nèi)壓增高甚至導(dǎo)致腦疝，從而引起嚴(yán)重的病理?yè)p害，增加顱腦傷病死率和致殘率[9]。本研究中，各模擬高原組腦組織干/濕比較平原組明顯升高，且隨著海拔升高，干/濕比增加，差異明顯；鏡下觀察各組大鼠腦組織病理切片，發(fā)現(xiàn)各模擬高原組不同程度腦血管水腫和細(xì)胞水腫，且隨著海拔升高，水腫程度加重，提示模擬高海拔低壓缺氧環(huán)境可以導(dǎo)致大鼠腦水腫，這些結(jié)果與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

綜上所述，模擬高海拔低壓缺氧環(huán)境可導(dǎo)致大鼠腦水腫，進(jìn)而造成大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，且隨海拔的升高，大鼠腦水腫程度加重，學(xué)習(xí)記憶功能下降越明顯。由此推測(cè)，高原腦水腫可能是引起缺氧導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降的原因之一。本研究也存在不足，高原腦損傷引起細(xì)胞水腫對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響機(jī)制還需要深入研究。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，考慮通過(guò)對(duì)腦組織的關(guān)鍵酶和介質(zhì)活性的調(diào)控的研究，找出干預(yù)大鼠高原缺氧環(huán)境下腦水腫發(fā)生的方法，為高原腦損傷的治療和預(yù)防尋找新的方式和作用靶點(diǎn)。

[1] 高伊新,李鵬,蔣春華,等.久居高原青年官兵腦功能的變化特征及其相關(guān)因素研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(10):1001-1004.

[2] Iswar Baitharu,Satya Narayan Deep,Vishal Jain.Corticosterone synthesis inhibitor metyrapone ameliorates chronic hypobaric hypoxia induced memory impairment in rat[J].Behavioural Brain Research,2012,228:53-65.

[3] 張峰,姚紅兵,李兵,等.慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA3區(qū)GFAP表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(12):1161-1163.

[4] Kalpana Barhwal,Shashi Bala Singh，Sunil Kumar Hota,et al.Acetyl-L-Carnitine ameliorates hypobaric hypoxic impairment and spatial memory deficits in rats[J].European Journal of Pharmacology,2007,570:97-107.

[5] Panchanan Maiti,Shashi B Singh,Muthuraju S,et al.Hypobaric hypoxia damages the hippocampal pyramidal neurons in the rat brain[J].Brain Research,2007,1175:1-9.

[6] Warner TA,Stafford NP,Rompala GR,et al.Intermittent swim stress causes Morris water maze performance deficits in a massed-learning trial procedure that are exacerbated by reboxetine[J].Pharmacol Biochem Behavior,2013,113:12-19.

[7] Kamper JE,Pop V,Fukuda AM,et al.Juvenile traumatic brain injury evolves into a chronic brain disorder:behavioral and histological changes over 6 months[J].Experimental Neurology,2013,250:8-19.

[8] Wang ZJ,Han WN,Yang GZ,et al.The neuroprotection of rattin against amyloid β peptide in spatial memory and synaptic plasticity of rats[J].Hippocampus,2014,24:44-53.

[9] 常玉坤,王麗娜,劉永亮,等.彌漫性腦損傷大鼠血腦屏障及損傷區(qū)皮質(zhì)咬合蛋白表達(dá)的變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,12(9):702-705.

Influence of simulated high attitude anoxia on rat's learning and memory and pathological changes of brain tissue

Zhang Yanchao,Li Yunming,Zhang Xinyan,Gu Jianwen

Department of Neurosurgery,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To observe the influence of simulated different high altitude anoxia on rat's space memory under low pressure and anoxia condition as well as the pathologic change of brain tissue.Methods 120 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: 4000 m group(n=30),6000 m group(n=30),8000 m group(n=30)and plain group(n=30).The rats in each of the first 3 groups were fed in the stimulated chambers of their fixed altitude for 3 days,while the rats in plain group were fed outside the chamber.8 rats were selected from each group and the mean escape latency(MEL)for the invisible platforms in Morris water maze automatic image collection system was recorded.Other 8 rats in each of the group fed in the chamber,as soon as they were taken out of the chamber,were killed as well as other 8 rats in plain group.Their brain tissues were taken out and the changes of water content were detected by dry weight method. HE stain method was applied to observe the pathological changes of the brain tissue.Results The Morris water maze analysis showed that the MEL in the 3 stimulated groups was longer than that in plain group(P<0.05);MEL got longer with the increase of altitude and the difference among the 3 stimulated groups was obvious(P<0.05).The same change of water content of the brain tissues was observed among the 3 stimulated groups(P<0.05)as MEL.Glial cells and peripheral vascular edema got worse with the increase of the altitude.Conclusions Low pressure and anoxia at high altitude may lead to brain edema of the rats and result in learning and memory block.

high altitude;anoxia;brain edema;learning and memory

國(guó)家自然科學(xué)基金(81000859)

610083 成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科(張艷超，李運(yùn)明，張新顏，顧建文)；成都軍區(qū)聯(lián)勤部第二門診部保健科(賈玉英)

顧建文，E-mail: 2914081083@qq.com

R 594.3/651.25

A

1004-0188(2014)04-0432-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.034

2014-01-20)