李凝詩，楊麗霞，郭瑞威，朱國(guó)富，齊 峰，葉金善

冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中microRNA-155及146a的表達(dá)水平

李凝詩，楊麗霞，郭瑞威，朱國(guó)富，齊 峰，葉金善

目的 觀察microRNA-155及146a在冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平。方法 148例心內(nèi)科住院患者分為兩組，對(duì)照組35例，冠心病組113例，冠心病組又分為3組，其中AMI組42例，UA組38例，SA組33例。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞上microRNA-155及146a表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，microRNA-155在冠心病組的表達(dá)水平降低，microRNA-146a升高(P<0.05)；AMI組及UA組患者的microRNA-155表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和SA組(P<0.05)，microRNA-146a的表達(dá)水平則高于對(duì)照組和SA組(P<0.05)，而AMI組及UA組兩組間無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 隨著冠心病病情的進(jìn)展，患者microRNA-155及146a的表達(dá)水平隨之改變，為冠心病患者的篩查及治療提供了一個(gè)新方向。

microRNA-155；microRNA-146a；冠心??；表達(dá)

microRNA(miRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，由20～23個(gè)核苷酸構(gòu)成，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及多種生物組織的發(fā)育調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化作為冠心病發(fā)生的基礎(chǔ)，已成為矚目的焦點(diǎn)。近年來，人們將其定義為一個(gè)慢性炎癥性疾病，而microRNA-155(miR-155)及microRNA-146a(miR-146a)為炎癥相關(guān)性miRNA。有研究[3]表明，miR-155可通過一些炎性因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生，繼而使炎癥反應(yīng)中的單核細(xì)胞增加。miR-146a則是通過上調(diào)核因子κB促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖和分化來參與炎癥反應(yīng)的形成[4]。本研究通過對(duì)冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155及miR-146a水平的檢測(cè)，分析其與病變程度的關(guān)系，探索其在冠心病中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年5月～2013年5月成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心內(nèi)科住院患者148例，根據(jù)臨床表現(xiàn)和冠脈造影分為冠心病組113例和對(duì)照組35例(無器質(zhì)性心臟病，心電圖檢查未見改變者)，冠心病組中又分為急性心肌梗死(AMI)組42例，不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組38例，穩(wěn)定型心絞痛(SA)組33例。冠心病組經(jīng)冠脈造影至少一支血管狹窄≥50%，對(duì)照組冠脈造影未見冠狀動(dòng)脈狹窄或痙攣。排除標(biāo)準(zhǔn)：原有心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病、病毒性心肌炎、風(fēng)濕性心肌炎以及外周血管?。缓喜⒏文I功能不全、腫瘤、DIC、血液系統(tǒng)疾病和免疫疾病。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè) 所有患者于冠脈造影時(shí)抽取橈動(dòng)脈血3 ml，全血置于1∶9枸櫞酸鈉抗凝管中，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；用血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(Bioteke Corporation)按操作說明提取總RNA；采用反應(yīng)體系共25 μl的All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(GeneCopoeia)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；采用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒(GeneCopoeia)進(jìn)行qPCR，每一反應(yīng)總體積20 μl；應(yīng)用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量(相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt)，同時(shí)以U6作為內(nèi)參。RT和PCR的特異性U6和miRNA引物由GeneCopoeia公司合成。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較 冠心病組除高脂血癥比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)外，年齡、性別、危險(xiǎn)因素間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2 兩組miR-155及146a的表達(dá)結(jié)果 冠心病組外周血單個(gè)核細(xì)胞上miR-155的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，miR-146a的表達(dá)顯著增高(P<0.05，表2)。

表1 兩組臨床資料比較

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

表2 兩組miRNA表達(dá)量比較表

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與SA組比較，②P<0.05

2.3 冠心病組各亞組miR-155及146a的表達(dá)結(jié)果 冠心病組中，不同臨床類型患者隨病情加重，miR-155的表達(dá)逐漸降低，即AMIUA>SA>對(duì)照組。AMI及UA組與對(duì)照組或SA組相比，miR-155的表達(dá)水平明顯下降，miR-146a的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。而AMI組及UA組相比，兩指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病產(chǎn)生的基礎(chǔ)，其由局部的脂質(zhì)和復(fù)合糖類的聚集、纖維組織的增生和鈣質(zhì)沉著相互作用，繼而出現(xiàn)斑塊的破裂及局部血栓的形成，因而免疫炎癥反應(yīng)正是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。近年來對(duì)新發(fā)現(xiàn)的由20～23個(gè)核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，即miRNA的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其是通過對(duì)目標(biāo)mRNA的翻譯進(jìn)行抑制或促使其降解，而參與到人體的多種生理和病理過程，起到調(diào)控的作用。最近有研究[5-6]提示，miRNA對(duì)在心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化中起到調(diào)節(jié)作用的單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的功能均有所影響，而miR-155及146a也包含其中。

miR-155及146a分別位于人類21號(hào)及5號(hào)染色體上，均是具有多種功能的miRNA。miR-155因在多種腫瘤疾病中表達(dá)，而一度被認(rèn)為是致癌因子。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)miR-155會(huì)因二氫茉莉酮酸甲酯的處理出現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象，從而使環(huán)氧化酶2的抗炎作用下降。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miR-155是具有免疫炎性的一種保護(hù)性miRNA，其可通過對(duì)一系列炎性因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用控制炎癥，減少對(duì)組織的傷害。并且發(fā)現(xiàn)miR-155可直接作用在血管緊張素Ⅱ-1型受體上，從而抑制血管緊張素Ⅱ與之相結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受阻，同時(shí)也抑制了血管緊張素Ⅱ-1型受體的轉(zhuǎn)錄水平，最終抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[8]。miR-146a是miR-146家族中的一種，在急性冠脈綜合征患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)明顯上升。miR-146a通過Toll樣受體通路對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過Toll樣受體4抑制巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝入及炎性因子的分泌，從而使巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)能力下降，使斑塊不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致斑塊破裂的可能性上升。miR-146a表達(dá)上調(diào)也可通過炎性因子對(duì)NFκB途徑的誘導(dǎo)而產(chǎn)生，同時(shí)，miR-146a也可通過NFκB促進(jìn)Th1的增殖和分化，即可加速炎癥的發(fā)生發(fā)展[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病組中miR-155的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而miR-146a的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)，冠心病組中隨病情的不斷加重，miR-155及146a的表達(dá)水平也有所不同，即miR-155的表達(dá)水平隨病情加重而下降，miR-146a則上升。

綜上所述，miR-155和miR-146a的表達(dá)水平與患者病情相關(guān)，其對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展可能起到重要作用。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，有望為預(yù)防和治療冠心病提供一個(gè)新靶點(diǎn)，為藥物的開發(fā)提供一個(gè)新思路。

[1] Wang GK,Zhu JQ,Zhang JT,et al.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[J].Eur Heart J,2010,31(6):659-666.

[2] Wang Y,J Chen,Q Li,et al.Identifying novel prostate cancer asso-ciated pathways based on integrative microarray data analysis[J].Comput Biol Chem,2011,35(3):151-158.

[3] Arnob Banerjeel,Felix Schambachl,Caitlin S de Jong,et al.Micro-RNA-155 inhibits IFN-c signaling in CD41 T cells[J].Eur J Immunol,2010,40:1-7.

[4] Guo M,Mao X,Ji Q,et al.MiR-146a in PBMCs modulates Th1 function in patients with acute coronary syndrome[J].Immunol Cell Biol,2010,88(5):555-564.

[5] Fichtlscherer S,De Rosa S,Fox H,et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease[J].Circ Res,2010,107(5):677-684.

[6] Lin Y,Liu X,Cheng Y,et al.Involvement of microRNAs in hydrogen peroxide-mediated gene regulation and cellular injury response in vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,2009,284(12):7903-7913.

[7] Hye-Ja Lee,Kyungah Maeng,Hung-The Dang,et al.Anti-inflamma-tory effect of methyl dehydrojasmonate(J2)is mediated by the NF-κB pathway[J].J Mol Med,2011,89(1):83-90.

[8] Ni Zhu,Dongze Zhang,Sifeng Chen,et al.Endothelial enriched mi-croRNAs regulate angiotensin Ⅱ-induced endothelial inflammation and migration[J].Atherosclerosis,2011,215(2):286-293.

[9] Yang K,He YS,Wang XQ,et al.MiR-146a inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced lipid accumulation and inflammatory response via targeting toll-like receptor 4[J].FEBS Lett,2011,585(6):854-860.

[10] Lu LF,Boldin MP,Chaudhry A,et al.Function of miR-146a in controlling treg cell-mediated regulation of Th1 responses[J].Cell,2010,142(6):914-929.

The expression of microRNA-155 and microRNA-146a in peripheral blood mononuclear cells in patients with coronary artery disease

Li Ningshi1,2,Yang Lixia1,Guo Ruiwei1,Zhu Guofu1,Qi Feng1,Ye Jinsan1

1.Department of Cardiology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China；2.Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the expression levels of microRNA-155 and microRNA-146a in peripheral blood mononuclear cells in patients with coronary heart disease(CAD).Methods 148 cases were divided into 2 groups: control group(n=35)and CAD group(n=113)who was sub-divided into 3 subgroups: AMI group(n=42),UA group(n=38)and SA group(n=33).Real-time quantitative PCR was applied to detect the expression of microRNA-155 and microRNA-146a in peripheral blood mononuclear cells.Results Comparing with the level in control group,the expression level of microRNA-155 was lower and microRNA-146a was higher in CAD group(P<0.05);the expression level of microRNA-155 in AMI group and in UA group was significantly lower than that in control group and in SA group(P<0.05),while the expression level of microRNA-146a in AMI group and in UA group was higher than that in control group and in SA group(P<0.05).No obvious difference in the expression level of microRNA-146a was detected between control group and SA group(P>0.05).Conclusions The expression of microRNA-155 and microRNA-146a changes with the progress of CAD,which provides a new method of the screening and clinical treatment of CAD.

microRNA-155;microRNA-146a;coronary artery disease;expression

650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心血管內(nèi)科(李凝詩，楊麗霞，郭瑞威，朱國(guó)富，齊 峰，葉金善)；昆明醫(yī)科大學(xué)(李凝詩)

楊麗霞,電話:0871-64774571;E-mail:doctorylixia@163.com.cn

R 541.4

A

1004-0188(2014)04-0380-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.012

2014-01-04)