李 明，周 永，譚宗才，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳，糜漫天

三羥異黃酮對(duì)HER2/neu高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

李 明，周 永，譚宗才，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳，糜漫天

目的 探討三羥異黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)、MCF-7/HER2(ER+,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)輻射敏感性的影響，并觀察三羥異黃酮對(duì)HER2/neu高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的作用。方法 通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立HER2/neu高表達(dá)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定；經(jīng)100 mol/L三羥異黃酮聯(lián)合或單獨(dú)10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2和MCF-7三種乳腺癌細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三羥異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響。結(jié)果 與對(duì)照組相比，MDA-MB-453、MCF-7/HER2細(xì)胞的射線組凋亡率無顯著差異(P>0.05)，三羥異黃酮聯(lián)合射線組的凋亡率，與射線組和對(duì)照組相比，分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7細(xì)胞射線組凋亡率比對(duì)照組增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯(lián)合射線組與射線組比較沒有顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 HER2/neu高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)射線誘導(dǎo)的凋亡有抵抗作用，但三羥異黃酮可增強(qiáng)γ射線誘導(dǎo)HER2/neu高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453細(xì)胞、MCF-7/HER2細(xì)胞的凋亡作用。

三羥異黃酮；人乳腺癌細(xì)胞；輻射敏感性；MCF-7/HER2;MDA-MB-453

乳腺癌是女性的常見惡性腫瘤。近20年來，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率明顯上升，成為危害女性健康的主要疾病之一。放射治療是乳腺癌治療中的一項(xiàng)重要手段，提高放療效果在臨床上非常必要[1]。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受體高表達(dá)。HER2/neu由原癌基因erbB-2/neu表達(dá)，為表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，具有絡(luò)氨酸激酶(PTK)活性。研究發(fā)現(xiàn)HER2/neu高表達(dá)乳腺癌惡性程度高，腫瘤生長(zhǎng)速度快，易轉(zhuǎn)移，對(duì)射線和化療藥物不敏感，治療預(yù)后差且易復(fù)發(fā)[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[3]，HER2/neu過度表達(dá)的乳腺癌對(duì)放療的敏感性低于HER2/neu低表達(dá)的乳腺癌，血清中HER2/neu胞外區(qū)蛋白水平升高與乳腺癌對(duì)放療的療效降低密切相關(guān)，提示HER2/neu表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞輻射抵抗有密切關(guān)系。三羥異黃酮是一種重要的天然植物雌激素，對(duì)人體無明顯毒副作用，其結(jié)構(gòu)與雌二醇非常相似，具有模擬和拮抗雌激素、抑制PTK活性等重要藥理作用[4-7]。本實(shí)驗(yàn)選擇兩種人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)，并通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立HER2/neu高表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞(MCF-7/HER2,ER+,HER2-high)，檢測(cè)三羥異黃酮對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株體外輻射敏感性的影響，觀察三羥異黃酮對(duì)HER2/neu高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12為HyClone公司產(chǎn)品；RPMI1640、胰蛋白酶為Gibco產(chǎn)品；新生胎牛血清購(gòu)自天津TBD公司；Genistein、MTT、曲拉通(Triton-X 100)為Sigma產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Promega公司；各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、購(gòu)自TaKaRa公司；Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；鼠抗人HER2/neu單克隆抗體購(gòu)自Zytmed公司；山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉公司。

1.2 質(zhì)粒 含人HER2/neu基因的質(zhì)粒pCMV/ERBB2由美國(guó)Anderson癌癥研究中心的Ming Tan教授惠贈(zèng)；含新霉素抗性基因的質(zhì)粒pCIneo由第三軍醫(yī)大學(xué)熊政碩士惠贈(zèng)。

1.3 細(xì)胞株及感受態(tài)細(xì)菌 MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-453均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。pCMV/ERBB2質(zhì)粒擴(kuò)增、酶切鑒定并測(cè)試濃度后與pCIneo質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞，400 μg/ml G418篩選MCF-7細(xì)胞，建立穩(wěn)定高表達(dá)HER2/neu的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/HER2)。DH5α感受態(tài)細(xì)菌由第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床生化教研室張竹君碩士惠贈(zèng)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MCF-7/HER2細(xì)胞株均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)，MCF-7/HER2培養(yǎng)基中加入100 μg/ml G418篩選細(xì)胞；MDA-MB-453細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增 按文獻(xiàn)[8]的方法，將pCIneo質(zhì)粒和含人HER2/neu基因的pCMV/ERBB2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α。按照Promega質(zhì)粒抽提試劑盒說明書，分別對(duì)上述二質(zhì)粒進(jìn)行提取、純化，并測(cè)定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 含人HER2/neu 基因的質(zhì)粒pCMV/ERBB2 經(jīng)擴(kuò)增、酶切鑒定和濃度測(cè)定后，與pCIneo質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7 乳腺癌細(xì)胞，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，然后在倒置熒光顯微鏡下初步觀察轉(zhuǎn)染是否成功。而后以400 μg/ml G418 初篩MCF-7細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞完全死亡后，以100 μg/ml G418 維持篩選，傳代并凍存?zhèn)溆茫庖邿晒饧?xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功。

2 結(jié)果

2.1 pCMV/ERBB2質(zhì)粒酶切鑒定 pCMV/ERBB2質(zhì)粒以ColE1為母本質(zhì)粒，在其中插入CMV強(qiáng)啟動(dòng)子和人erbB-2/neu cDNA基因構(gòu)建而成。根據(jù)pCMV/ERBB2質(zhì)粒圖譜(圖1)，該質(zhì)粒全長(zhǎng)9130 bp，含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其中包括2個(gè)Hind Ⅲ和1個(gè)XhoⅠ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切pCMV/ERBB2質(zhì)粒后，電泳所得3個(gè)DNA片段為4479 bp(含erbB-2/neu片段)、3593 bp(含CMV啟動(dòng)子)和1026 bp，符合理論計(jì)算值(圖1)。

圖2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定HER2轉(zhuǎn)染前后的MCF-7細(xì)胞(×600)

A：對(duì)照；B：pCIneo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞(白色箭頭所示為pCIneo蛋白)；C：pCIneo和PCMV/ERBB2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞(白色箭頭所示為pCIneo蛋白，灰色箭頭所示為HER2蛋白)

圖1 pCMV/ERBB2和pCIneo質(zhì)粒鑒定

M：Marker；1和3：pCMV/ERBB2質(zhì)粒酶切片段；2和4：pCMV/ERBB2質(zhì)粒；5：pCIneo質(zhì)粒

2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定pCIneo和PCMV/ERBB2共轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞 PCMV/ERBB2質(zhì)粒擴(kuò)增、酶切鑒定并測(cè)試濃度后，與含新霉素抗性基因的空載體pCIneo質(zhì)粒(帶有綠色熒光信號(hào))共轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定。如圖2所示，PCMV/ERBB2質(zhì)粒和含新霉素抗性基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)分別可見紅色和綠色熒光，而只轉(zhuǎn)染含新霉素抗性基因質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)可見綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞則無任何熒光信號(hào)。結(jié)果表明，在PCMV/ERBB2轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，HER2/neu高表達(dá)，主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；而在單獨(dú)轉(zhuǎn)染含新霉素抗性基因質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞，HER2/neu不表達(dá)，提示成功地將PCMV/ERBB2質(zhì)粒和pCIneo質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入了MCF-7細(xì)胞。

2.3 三羥異黃酮聯(lián)合γ射線對(duì)MCF-7、MCF-7/HER2、MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)100 mol/L三羥異黃酮聯(lián)合或單獨(dú)10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三種乳腺癌細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)MDA-MB-453、MCF-7/HER2細(xì)胞的射線組凋亡率，與對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05)，而三羥異黃酮聯(lián)合射線組的凋亡率分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7細(xì)胞射線組凋亡率，與對(duì)照組相比增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯(lián)合射線組與射線組比較無明顯差異(P>0.05)，提示HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)射線誘導(dǎo)的凋亡有抵抗作用，但三羥異黃酮可增強(qiáng)γ射線誘導(dǎo)HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用。見表1。

表1 不同條件處理24 h后細(xì)胞凋亡率的變化(n=3,%)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與γ射線組比較，②P<0.01

3 討論

乳腺癌的綜合治療中，放射治療與手術(shù)治療一樣屬于局部治療，占有十分重要的地位。但多種因素會(huì)影響放療的效果，如腫瘤組織的低氧狀態(tài)、腫瘤本身的放射敏感性以及腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的抵抗等。放射線入射生物體后，直接損傷大分子DNA，或通過其產(chǎn)生的自由基的間接作用，導(dǎo)致DNA損傷或細(xì)胞死亡等生物效應(yīng)。這種應(yīng)用放射治療腫瘤的方法，就是放射治療(放療)。放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一，但由于個(gè)體之間或腫瘤細(xì)胞本身對(duì)射線的反應(yīng)存在很大差異，即存在細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性(intrinsic radiosensitivity)差異，往往導(dǎo)致療效不佳。因此如何提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性一直是腫瘤放射領(lǐng)域中備受關(guān)注的問題。已有為數(shù)不多的放射增敏劑應(yīng)用于臨床或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。放射增敏劑是化學(xué)修飾的一種。所謂化學(xué)修飾是指在癌癥的治療中，主要通過其對(duì)腫瘤及正常組織的放射及/或藥物的修飾效應(yīng)，而不是其細(xì)胞毒作用起效的一類藥物[9]。三羥異黃酮又名染料木素或金雀異黃酮，為大豆異黃酮主要成分之一，是一種重要的天然植物雌激素，具有雌二醇母核機(jī)構(gòu)，對(duì)人體無明顯毒副作用。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，三羥異黃酮可通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因來抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，三羥異黃酮通過抑制NF-κB和Akt活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的抑制。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受體高表達(dá)。HER2/neu受體為表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，具有PTK活性。HER2/neu高表達(dá)乳腺癌惡性程度高，腫瘤生長(zhǎng)速度快，易轉(zhuǎn)移，對(duì)射線和化療藥物的不敏感，治療預(yù)后差且易復(fù)發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，三羥異黃酮作為一種TPK抑制劑，能夠通過抑制射線誘導(dǎo)激活的AKT細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路來促進(jìn)食管癌細(xì)胞的輻射敏感性。本實(shí)驗(yàn)以MDA-MB-453、 MCF-7、MCF-7/HER2乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，經(jīng)100 mol/L三羥異黃酮聯(lián)合或單獨(dú)10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三種乳腺癌細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)HER2/neu高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、MCF-7/HER2的射線組凋亡率，與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，而三羥異黃酮聯(lián)合射線組的凋亡率分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；HER2/neu低表達(dá)或不表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7射線組凋亡率，與對(duì)照組相比增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯(lián)合射線組與射線組比較沒有顯著差異(P>0.05)；該結(jié)果提示HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)射線誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗作用，而三羥異黃酮能有效地增強(qiáng)HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。我們推測(cè)三羥異黃酮增強(qiáng)HER2/neu高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性與其抑制HER2/neu的TPK活性有關(guān)。

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Effect of Genistein on Radiosensitivity of Breast Cancer Cells with High Expression of HER2/neu

Li Ming1,Zhou Yong2,Tan Zongcai3,Xu Min1,Zheng Junfen1,Chang Lei1,Zhang Lin1,Qu Lin1,Mi Mantian2

1.Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Staff Room of Nutrition and Food Hygiene,College of Military Preventive Medicine,the Third Military Medical University,Chongqing,400037,China;3.The Second Regiment,Comprehensive Training Base of Guangzhou Military Command,Zhuzhou,Guangzhou,412005,China

Objective To investigate the effects of genistein on the radiosensitivity of human breast cancer cell strains with expression of MDA-MB-453(ER-,HER2-high),MCF-7(ER+,HER2-high),and MCF-7/HER2(ER+,HER2-low),and to observe the effects of genistein on the radiosensitivity of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells.Methods Highly expressed HER2/neu human breast cancer cell MCF-7 was constructed through cell transfection technology and was identified by immunofluorescence cytochemical technology.After the three kinds of breast cancer cells i.e.MDA-MB-453,MCF-7/HER2,and MCF-7 were treated by 100 μmol/L genistein combined with or simply use of 10 Gy γ ray,flow cytometry was used to analyze the effects of genistein on the radiosensitivity of the breast cancer cells.Results There was no significant difference between the apoptotic rates of MCF-7/HER2 and MDA-MB-453 cells treated by γ ray compared with those of the control group(P>0.05).The apoptotic rates of those cells treated by genistein combined with γ ray increased by 25.51%(P<0.05)and 56.16%(P<0.05),respectively,compared with those of the cells treated only by γ ray and the control group.The apoptotic rate of MCF-7 cells treated by γ ray increased by 4.62%(P<0.05)compared with that of the control group(P<0.05),but there was no significant difference between the apoptotic rates of the cells in the γ ray and the control group(P>0.05).Conclusions HER2/neu highly expressed breast cancer cells have resistant effect on the apoptosis induced by γ ray,but genistein can increase the apoptotic effect of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells induced by γ ray.

genistein;tumor;γ ray; MDA-MB-453; radiosensitivity;MCF-7 HER2

重慶市自然科學(xué)基金(CSTC 2006 BB 5103)

610021 成都，成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心(李 明，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳)；第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室(周 永，糜漫天)；廣州軍區(qū)綜合訓(xùn)練基地二大隊(duì)(譚宗才)

糜漫天，電話：023-687752292

R 737.9

A

1004-0188(2014)04-0358-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.004

2014-01-28)