晏 燕，周 云，壯 榮，曹 軍

白介素-1β對人牙周膜成纖維細胞MMP-13表達影響的研究

晏 燕，周 云，壯 榮，曹 軍

目的 探討白介素-1β(IL-1β)對人牙周膜成纖維細胞(hPDLFs)中基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)表達影響的研究。方法 體外分離培養(yǎng)hPDLFs并隨機分為對照組和實驗組，對照組中加入等量無血清培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度IL-1β(0 ng/ml、0.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)作用hPDLFs 24 h。采用RT-PCR檢測MMP-13 mRNA的表達情況，并選取最適濃度作用24 h，采用Western blot檢測MMP-13蛋白表達的變化情況。結(jié)果 實驗組與對照組比較，MMP-13在IL-1β濃度為10 ng/ml和20 ng/ml時mRNA表達最為明顯(P<0.05)，10 ng/ml組和20 ng/ml組MMP-13 mRNA表達相比較，無明顯差異(P>0.05)。采用10 ng/ml IL-1β作為最適濃度進行刺激，并作用hPDLFs 24 h，與對照組比較，MMP-13蛋白表達顯著增加，具有顯著差異性(P<0.05)。結(jié)論 在IL-1β調(diào)控下，hPDLFs中MMP-13的表達顯著增加，并呈明顯的濃度依賴性，而MMP-13表達的增加可能是引起正畸治療過程中牙根吸收的重要機制之一。

基質(zhì)金屬蛋白酶-13；白介素-1β；人牙周膜成纖維細胞

正畸治療的目的是高效移動牙齒，同時降低對牙齒及其牙周組織的傷害。而牙根吸收作為正畸治療的一個不良反應(yīng)在臨床上很常見，但其具體的分子生物學(xué)機制卻不明確[1-2]。有研究顯示[3-5]，當牙根吸收時，其局部區(qū)域的牙周膜組織IL-1β表達明顯增強，而MMP-13屬于間質(zhì)性膠原酶，可以降解牙周組織中最具特征的Ⅰ型膠原。本研究擬采用體外細胞學(xué)研究方法，運用RT-PCR及Western blot觀察IL-1β對hPDLFs中MMP-13表達有何影響，初步探討在正畸治療發(fā)生的牙根吸收過程中，IL-1β與MMP-13之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備 重組人IL-1β(Peprotech公司，美國)； RT-PCR試劑盒(Takara公司，日本)；鼠抗人MMP-13單克隆抗體(Abcom公司，美國)； MMP-13引物合成(上海生工公司)； RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；垂直電泳槽、電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移電泳槽(Bio-Rad公司，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙周膜成纖維細胞(hPDLFs)的原代培養(yǎng) 選取青少年正畸患者因正畸需要拔除的健康前磨牙，即刻放入含雙抗的DEME液中，于超凈臺中反復(fù)用PBS液沖洗后，刮取根中1/3牙周膜組織，參照文獻[6-7]進行組織塊法進行原代培養(yǎng)，傳代并擴大培養(yǎng)，用于以下實驗。

1.2.2 MMP-13 mRNA表達的檢測 取生長良好的第3～6代hPDLFs細胞，用2.5 g/L胰酶消化，調(diào)整細胞密度為1×105/ml并接種于6孔板，分別設(shè)置5個IL-1β濃度梯度組(0 ng/ml、0.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)，待細胞充分貼壁并達到80%匯合時，更換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞進入相對同步化后，加入各不同濃度IL-1β，標準環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將每孔均加入1 ml Trizol裂解hPDLFs約5 min，按步驟提取細胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取部分反轉(zhuǎn)錄樣品直接進行qRT-PCR反應(yīng)。相關(guān)引物由上海生工合成，引物序列如下：MMP-13：F：ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG；R：GAACCCCGCATCTTGGCTT；β-actin：F：CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT；R：CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC。反應(yīng)體系共25 μl。采用相對定量分析法分析。

1.2.3 Western blot法檢測hPDLFs中MMP-13蛋白的表達 取生長良好的第3～6代hPDLFs細胞，用2.5 g/L胰酶消化后接種于50 ml培養(yǎng)瓶，取上述IL-1β最適濃度作為實驗組，與加入等量無血清培養(yǎng)液的對照組比較。提取細胞總蛋白后，采用BCA法測定蛋白濃度，按照所測目的蛋白的大小，配置SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質(zhì)電泳，采用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至含有50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉液中，搖床室溫封閉2 h后。分別加入1∶1000稀釋的MMP-13、GAPDH抗體中，4 ℃過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h。洗滌后，暗室內(nèi)用ECL法在反應(yīng)液中反應(yīng)2～3 min后拍片顯影。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度IL-1β對hPDLFs中MMP-13表達的影響 從圖1可看出，隨著IL-1β作用的濃度升高，MMP-13 mRNA表達逐漸增高。當IL-1β達到10 ng/ml和20 ng/ml時，MMP-13 mRNA的表達與對照組相比有顯著的差異性(P<0.05)，但這兩組之間并無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同濃度IL-1β作用后MMP-13的相對mRNA表達

2.2 MMP-13蛋白的表達 選擇10 ng/ml IL-1β作為最適濃度作用于hPDLFs 24 h后，MMP-13蛋白的表達為0.75±0.29，顯著高于對照組的0.45±0.02(P<0.05)。

3 討論

牙根吸收是正畸治療過程中較為嚴重的并發(fā)癥，目前主要通過輕力矯治、縮短療程、定期的影像學(xué)觀察進行預(yù)防，但始終缺乏一種主動的措施能夠防止牙根吸收的發(fā)生。

IL-1是已知的介導(dǎo)炎性的細胞因子，可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生急性或慢性炎癥，AI-Qawasmi等[8]已經(jīng)證實，IL-1β基因與牙根吸收的發(fā)生有著密切聯(lián)系。Okamura等[9]通過原位雜交的方法，在牙根吸收的組織中也檢測到IL-1 mRNA，并指出IL-1是增強牙根吸收的一個重要因子。研究顯示[10]，牙根吸收與骨吸收比較類似，包括礦物質(zhì)的溶解和有機質(zhì)的降解，而基質(zhì)金屬蛋白酶是鋅肽酶家族的一員，幾乎可以降解細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的所有成分。Delaisse等[11]的研究也確定，MMPs是細胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶。MMP-13屬于間質(zhì)膠原酶，不僅降解牙周組織中最具特征的Ⅰ型膠原，激活MMP-9[12]，更能把膠原纖維進一步降解到更小的分子量，更加充分地降解細胞外基質(zhì)。同時暴露有機質(zhì)層下的礦物質(zhì)；誘導(dǎo)分化及活化破骨細胞，從而導(dǎo)致根面破骨性吸收。Peeters-Joris等[13]的研究證實，與其他MMPs相比， MMP-13在骨基質(zhì)降解過程中起了重要的作用。因此，MMP-13在牙根吸收中作為蛋白質(zhì)酶發(fā)揮著重要作用，但這兩者之間的聯(lián)系究竟怎樣呢？

本研究利用IL-1β作用于體外培養(yǎng)的hPDLFs，初步觀察到IL-1β介導(dǎo)下MMP-13表達情況，且伴隨IL-1β濃度增加，MMP-13的表達呈一定的正相關(guān)性。并使用10 ng/ml IL-1β作為最適濃度作用于hPDLFs 24 h后，提取細胞總蛋白進行檢測，實驗組與對照組比較，MMP-13的蛋白表達具有顯著差異。該結(jié)論表明，在IL-1β介導(dǎo)下，MMP-13表達的增加可能是產(chǎn)生牙根吸收的原因之一。進一步提示，抑制IL-1β的活性，將可能有助于抑制牙根吸收。

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Research off effects of interleukin-1β on the expression of MMP-13 in human periodontal ligament fibroblasts

Yan Yan,Zhou Yun,Zhuang Rong,Cao Jun

Department of Orthodontics,the Dental Hospital of the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shanxi,710032,China

Objective To investigate the effects of interleukin-1β on the expression of matrix metalloproteinase-13(MMP-13)in human periodontal ligament fibroblasts(hPDLFs).Methods The hPDLFs isolated and cultuered in vitro were randomly divided into control and exprimental groups.Serum-free medium was added in the control group,while different concentration of IL-1β(0 ng/ml,0.5 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,and 20 ng/ml)was added in the exprimental groups to culture hPDLFs for 24 h.Then real-time PCR was used to detect the expression of MMP-13 mRNA,and the optimal concentration was selected to culture hPDLFs for 24 h.The changes of the expression of MMP-13 were detected by Western blot.Results Compared with the control group,the mRNA expression of MMP-13 in the experimental groups were most obvious when the concentration of IL-1β was 10 ng/ml and 20 ng/ml(P<0.05),but there was no significant difference of the expression between the concentration of 10 ng/ml and 20 ng/ml(P>0.05).The best concentration for the stimulus of IL-1β was 10 ng/ml.When hPDLFs were cultured with this concentration for 24 h,the MMP-13 protein expression increased significantly compared with that in the control group,and there were significant differences between the two groups(P<0.05).Conclusion Under the regulation of IL-1β,the expression of MMP-13 in hPDLFs significantly increases and has obvious concentration dependency.The increase of MMP-13 expression may be one of the most important mechanisms of dental root absorption during the orthodontic treatment.

matrix metalloproteinase-13;interleukin-1β;human periodontal ligament fibroblast

國家自然科學(xué)基金資助項目(81070870)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科

曹 軍，E-mail:wykun@fmmu.edu.cn

R 781.4

A

1004-0188(2014)02-0120-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.002

2013-10-08)