牛青梅 周慶頌 孫若飛

紫外分光光度法測定犬血漿中美沙拉嗪的藥物濃度

牛青梅 周慶頌 孫若飛

目的建立測定犬血漿中美沙拉嗪濃度的紫外分光光度法(UV)。方法以5%三氯乙酸沉淀蛋白, 在紫外吸收波長303 nm處測定吸光度值。結(jié)果回歸方程為Y=0.0051X+0.0277(r=0.9997),線性范圍40～160 μg/ml；美沙拉嗪低、中、高3種濃度方法回收率分別為(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%；日內(nèi)精密度RSD分別為2.17%、1.75%、2.21%, 日間精密度RSD分別為1.88%、1.68%、1.63%。結(jié)論紫外分光光度法簡單、準(zhǔn)確、成本低, 為后續(xù)開展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

紫外分光光度法；血藥濃度；美沙拉嗪

美沙拉嗪(5-ASA)是治療潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和節(jié)段性回腸炎(克羅氏病, crohn's disease, CD)的主要藥物之一［1］。目前美沙拉嗪血藥濃度測定方法基本是采用高效液相色譜法(HPLC), 但是HPLC法測定5-ASA血藥濃度的方法前處理復(fù)雜, 對儀器要求較高, 而一些體外藥物代謝動力學(xué)實驗, 如血漿蛋白結(jié)合率測定、離體(或在體)腸吸收實驗等采用HPLC法進(jìn)行藥物濃度測定非常不便。作者采用UV法, 以5%三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白后建立了測定犬血漿中5-ASA濃度的方法。該方法具有專屬性強、血漿用量少、準(zhǔn)確、快捷方便等特點, 適用于一些體外藥物代謝動力學(xué)試驗中5-ASA藥物濃度的測定。

1 材料與方法

1.1材料 UV-2550紫外分光光度計(日本島津)；XS205 Dualrange電子天平(瑞士METTLER, 精度十萬分之一)；Vortex Genie2 渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；ANKE TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；5-ASA對照品(上海金錦樂股份有限公司, 純度＞98%), 犬血漿(北京平睿生物科技有限公司), 三氯乙酸(天津大茂化學(xué)試劑廠, 純度＞99%), 其他試劑均為分析純, 實驗用水為雙蒸水。

1.2方法

1.2.1美沙拉嗪系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的配制 精密稱取磷酸氫二鉀14.11 g, 磷酸二氫鉀2.59 g, 氯化鈉1.99 g, 定容至1000 ml即得。

1.2.1.2系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取5-ASA對照品160 mg, 置于100 ml量瓶中, 用PBS緩沖液稀釋至刻度, 得質(zhì)量濃度為1.60 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別用PBS緩沖液稀釋配制成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,冷藏保存。

1.2.2血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品800 μl, 置5 ml離心管中, 加入PBS緩沖液, 旋渦混合30 s后加入蛋白沉淀劑(5%三氯乙酸溶液)800 μl, 旋混1 min, 10000 r/min離心15 min, 取上清液, 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后取續(xù)濾液, 即得。

1.2.3方法專屬性及測定波長的選擇 取空白血漿、含藥(5-ASA)血漿分別經(jīng)“1.2.2”項方法處理后對其進(jìn)行紫外光譜全掃描, 結(jié)果見圖1。光譜對比表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在檢測波長303 nm處無干擾, 專屬性良好, 因此選擇303 nm作為測定波長。

圖1 血漿樣品UV掃描圖譜(A含藥血漿；B空白血漿)

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取空白血漿800 μl, 置5 ml離心管中, 分別加入“1.2.1”項下制備的不同質(zhì)量濃度的5-ASA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液80 μl, 旋渦混合30 s, 得到含5-ASA濃度分別為40、60、80、100、120、140、160 μg/ml的血漿樣品。按“1.2.2”項下方法處理；同時取空白血漿800 μl, 加入80 μl PBS緩沖液, 同法處理作為空白；按照UV法［1］, 在303 nm波長處測定吸光度, 以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5方法回收率與精密度 分別于800 μl的空白血漿中加入低、中、高3種濃度(600、1000、1400 μg/ml)的5-ASA對照品溶液80 μl, 混勻, 得低、中、高3種不同濃度美沙拉嗪的血漿樣品, 按“1.2.4”項下方法處理并測定, 將5-ASA的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算5-ASA 血藥濃度, 以測得值與加入值之比計算方法回收率。以1 d內(nèi)測得的5-ASA濃度計算日內(nèi)精密度, 以1周內(nèi)5次測定的5-ASA濃度計算日間精密度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用 DAS2.0藥物代謝動力學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。相關(guān)結(jié)果比較采用回歸分析。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗數(shù)據(jù)如表1所示, 回歸方程為：Y=0.0051X+0.0277, 相關(guān)系數(shù)r=0.9997, 美沙拉嗪在40～160 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2回收率及日內(nèi)精密度 回收率及日內(nèi)精密度試驗結(jié)果如表2所示。低、中、高3種質(zhì)量濃度的平均方法回收率分別為(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%(n = 6)。低、中、高3 種質(zhì)量濃度的日內(nèi)RSD分別為2.17%、1.75%、2.21%。

2.3日間精密度試驗 1周內(nèi)連續(xù)5個工作日測定所得日間精密度, 結(jié)果如表3所示。低、中、高3 種質(zhì)量濃度的日間RSD分別為1.88%、1.68%、1.63%。

表1不同濃度美沙拉嗪血漿UV測定結(jié)果(n=3)

表2回收率及日內(nèi)精密度試驗結(jié)果(n=6)

表3日間精密度試驗結(jié)果(n=6, d=5)

3 討論

本試驗選取5%三氯乙酸溶液直接沉淀蛋白的方法測定5-ASA 血藥濃度。該方法簡化了樣品預(yù)處理過程, 可在短時間內(nèi)處理大批樣品, 具有簡便迅速, 蛋白清除完全, 靈敏度及回收率高的特點。由于三氯乙酸的酸性較大, 加入后使5-ASA吸收波長藍(lán)移, 其最大吸收波長由330 nm變?yōu)?03 nm。測定過程中作者采用空白血漿按含藥血漿相同方法進(jìn)行處理作為空白對照, 能有效去除血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾［3］。本試驗所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為40～160 μg/ml, 基本能夠滿足大部分體外藥物代謝動力學(xué)試驗的測定需要。

［1］ 劉偉.潰瘍性結(jié)腸炎的藥物治療現(xiàn)狀與前景.國外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊), 2003, 23(5):261-263.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典(二部).北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:30-31.

［3］ 熊鳳英, 簡潔, 周淑群, 等.紫外分光光度法測定米非司酮血藥濃度.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2008, 18(6):262-263.

The Determination of mesalazine in dog plasma by UV-spectrophotometry

NIU Qing-mei, ZHOU Qingsong, SUN Ruo-fei.
School of Pharmacy, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China

ObjectiveTo establish UV-spectrophotometry (UV) method for the determination of mesalazine in dog plasma.MethodsSerum protein was precipitated with 5% trichloroacetic acid, and the absorbance value at 303 nm was detected.ResultsThe regression equation was Y=0.0051 X+0.0277 (r=0.9997), and the linear response range was 40～160 μg/ml.The recovery rates of mesalazine in three different concentrations were (97.16±2.37)%, (98.92±1.84)%, (98.41±2.29)% respectively.The RSD of intra-day precision was 2.17 %, 1.75%, 2.21%.The RSD of inter-day precision was 1.88 %, 1.68 %, 1.63 % respectively.ConclusionThe UV method is simple, accurate and low-cost, which can lay the foundation for the further research.

UV-spectrophotometry; Blood concentration; Mesalazine

2014-08-08］

國家自然科學(xué)基金項目(項目編號：81160397)

330013 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院

周慶頌