仝品芬，王文廣，匡德宣，張 媛，孫曉梅，代解杰

(中國(guó)協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

研究報(bào)告

不同來(lái)源樹(shù)鼩的弓形蟲(chóng)感染調(diào)查

仝品芬，王文廣，匡德宣，張 媛，孫曉梅，代解杰

(中國(guó)協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

目的 調(diào)查不同群體樹(shù)鼩弓形蟲(chóng)的感染情況，為建立樹(shù)鼩寄生蟲(chóng)學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供依據(jù)。方法 分別從野外來(lái)源、人工馴化一年和人工繁殖的子一代三個(gè)樹(shù)鼩群體中，隨機(jī)采集動(dòng)物全血樣本各40份，用間接血凝試驗(yàn)(IHA)檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體，PCR方法檢測(cè)其核酸，根據(jù)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果分析樹(shù)鼩弓形蟲(chóng)的感染情況。結(jié)果 IHA和PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，120份樹(shù)鼩血樣均為陰性，兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致。結(jié)論 本次調(diào)查三個(gè)群體來(lái)源的樹(shù)鼩均未感染弓形蟲(chóng)，樹(shù)鼩對(duì)弓形蟲(chóng)的易感情況還需要通過(guò)擴(kuò)大樣本量和感染性實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

樹(shù)鼩; 弓形蟲(chóng); 間接血凝試驗(yàn); 聚合酶鏈反應(yīng)

樹(shù)鼩(tree shrew，Tupaiabelangeri)的基因組分析發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)、代謝和免疫系統(tǒng)等方面與人類具有較高的同源性，特別適合于病毒免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和代謝性疾病研究，受到了科研工作者的重視[1]。樹(shù)鼩作為我國(guó)特有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種，開(kāi)展樹(shù)鼩規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化種群的飼養(yǎng)繁殖是一項(xiàng)重大的基礎(chǔ)性工作，雖然近年來(lái)在馴養(yǎng)繁殖、種群建立、生物學(xué)特性研究、自身攜帶微生物情況以及人類疾病模型建立等方面取得了可喜的進(jìn)展，但是離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化仍有較大差距[2,3]。

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)病是常見(jiàn)的人獸共患疾病，可引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)、死胎，甚至導(dǎo)致患病動(dòng)物大批死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 弓形蟲(chóng)被列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的必檢項(xiàng)目。本文采用間接血凝法和PCR法對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行弓形蟲(chóng)檢測(cè)，以了解弓形蟲(chóng)感染樹(shù)鼩的情況，為制定樹(shù)鼩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK(滇)K2013-0001，SYXK(滇)K2013-0001]，來(lái)源于野外、馴化飼養(yǎng)一年和人工繁殖子一代3個(gè)群體，每個(gè)群體隨機(jī)挑選40只，分為三個(gè)組，共120只。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑：電熱恒溫培養(yǎng)箱(78-1，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Hitachi，CT15RE)，梯度PCR儀(Bio-Rad，CFX96TMReal-Time PCR Dection System)，數(shù)顯恒溫振蕩器(ZD-85，杭州貴馳科技有限公司)。 弓形蟲(chóng)間接血凝試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(批號(hào)：130815)，電泳儀(Bio-Rad, PowerPac Basic),弓形蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 間接血凝試驗(yàn)：(1)弓形蟲(chóng)IHA診斷制劑按使用說(shuō)明標(biāo)示加入滅菌蒸餾水稀釋搖勻，2 000 r/min離心5 min～10 min，棄上清液，加等量稀釋液搖勻，置4℃下靜置24 h使用，10 d內(nèi)效價(jià)不變。(2)每只樹(shù)鼩取全血0.3 mL，室溫下靜置1 h，4℃冰箱靜置1.5 h。4 000 r/min離心5 min，分離血清。 (3)用微量移液器在96 孔有機(jī)玻璃反應(yīng)板上每孔加0.075 mL稀釋液。檢測(cè)時(shí)每個(gè)樣品需加稀釋液4孔。分別再加陰性對(duì)照血清，陽(yáng)性對(duì)照血清和待檢血清：第一孔加相應(yīng)血清0.025 mL，倍比稀釋至第3孔，第4孔為稀釋液對(duì)照。(4)加診斷液：將診斷液搖勻，每孔加0.025 mL診斷液，加完后將反應(yīng)板置微型震蕩器上震蕩1 min～2 min，取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃置22℃～37℃作用2 h～3 h后觀察結(jié)果。出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性，仍呈混勻狀未凝集者為陰性，難于判斷時(shí)需重做一次。

1.2.2 PCR檢測(cè)：(1) 外周全血中DNA 的制備：采集樹(shù)鼩血0.2 mL，EDTA抗凝，按照試劑盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit(Code No.9781)進(jìn)行DNA提取。(2) PCR 擴(kuò)增： 引物：根據(jù)P30基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，目的片段914 bp，

F: 5′-TTGCCGCGCCCACACTGATG-3′； R: 5′-CGCGACACAAGCTGCGATAG-3′ PCR反應(yīng)按照PCR Amplification Kit (Code No. R011)試劑盒操作進(jìn)行，體系總體積50 μL，內(nèi)含10× PCR buffer(含Mg2 +)5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各1 μL(終濃度0.2 μmol/L)，模板DNA 2 μL，TaKaRa Taq 0.25 μL，補(bǔ)充去離子水至50 μL。上述反應(yīng)混合物于94℃×5 min預(yù)變性后，在經(jīng)過(guò)94℃×30 s， 55℃×30 s，72℃×30 s，25個(gè)循環(huán)后，再經(jīng)過(guò)72℃延伸5 min。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，1.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，對(duì)照位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶者為陽(yáng)性，無(wú)條帶者為陰性，條帶不清晰的重做一次。

2 結(jié)果

2.1 間接血凝試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性和陰性對(duì)照成立，所有三組樹(shù)鼩樣品均未出現(xiàn)凝集，全部為陰性結(jié)果(表1)。

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照樣本出現(xiàn)單一條帶，片段大小與設(shè)計(jì)目的片段914 bp一致，3組樹(shù)鼩全血DNA樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳均未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，結(jié)果見(jiàn)(表1和圖1)。

表1 三個(gè)群體樹(shù)鼩的弓形蟲(chóng)檢測(cè)間接血凝試驗(yàn)和PCR結(jié)果Tab.1 Results of IHA and PCR for Toxoplasma gondii in the tree shrews

注：-：陰性，+：陽(yáng)性

Note.-：Negative，+：Positive

注: M: Marker( DL2000)，泳道 0:陽(yáng)性對(duì)照，泳道1-12:樹(shù)鼩樣品圖1 樹(shù)鼩全血DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Note. M: Marker (DL2000); Track 0: Psitive control; Track 1-12: Samples from tree shrewsFig.1 Results of electrophoresis of whole blood DNA from the tree shrews

從間接血凝試驗(yàn)和PCR檢測(cè)結(jié)果可看出，兩種檢測(cè)結(jié)果完全一致,且均為陰性，說(shuō)明所檢測(cè)的三組樹(shù)鼩的樣品無(wú)弓形蟲(chóng)感染。

3 討論

弓形蟲(chóng)是細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)有極廣泛的地理區(qū)域和宿主范圍，貓是弓形蟲(chóng)的終宿主兼中間宿主，能感染哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類，包括人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物。弓形體病為世界性分布的危害較大的人獸共患病。弓形蟲(chóng)感染一般呈隱性，無(wú)明顯的臨床癥狀。貓科動(dòng)物是弓形蟲(chóng)病傳播過(guò)程中惟一的終末宿主，也是惟一的可以排泄含有弓形蟲(chóng)的卵囊到環(huán)境中的動(dòng)物，弓形蟲(chóng)在其腸道內(nèi)通過(guò)有性生殖產(chǎn)生大量的卵囊，卵囊隨著糞便而散播到環(huán)境之中，動(dòng)物或人類一旦不小心進(jìn)食被卵囊污染的食物或者水就很有可能感染弓形蟲(chóng)[4]。

野生動(dòng)物在飲食習(xí)慣和食物種類方面具有多樣性，從而感染弓形蟲(chóng)的幾率也有所不同[5]。Millcin J等調(diào)查了西班牙東部馬洛卡地區(qū)的野生貓科動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)氐囊柏埞蜗x(chóng)陽(yáng)性率甚至高達(dá)84.7%[6]。從有關(guān)研究結(jié)果中可以看到，野生貓科動(dòng)物弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率很高，野生犬科動(dòng)物也具有較高的感染率，而且肉食野生動(dòng)物的弓形蟲(chóng)感染率一般要高于雜食野生動(dòng)物和草食野生動(dòng)物，而雜食野生動(dòng)物的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率基本上要高于草食野生動(dòng)物[7]。野生樹(shù)鼩屬雜食類動(dòng)物，食物主要以植物性糧食、水果和少量蟲(chóng)卵為主。不過(guò)從間接血凝試驗(yàn)和PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性來(lái)看，野外來(lái)源樹(shù)鼩無(wú)弓形蟲(chóng)感染，也是馴化養(yǎng)殖樹(shù)鼩和人工繁殖子一代樹(shù)鼩也無(wú)弓形蟲(chóng)感染的客觀因素，或者也可能是樹(shù)鼩本身就不易感染弓形蟲(chóng)的原因造成的。但由于本次采樣數(shù)量的局限性，樹(shù)鼩對(duì)弓形蟲(chóng)的易感情況還需要通過(guò)擴(kuò)大樣本量和感染性實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來(lái), 弓形蟲(chóng)病的診斷方法以普通病原學(xué)和免疫學(xué)診斷為主, 而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展, 逐步建立了核酸探針、PCR、基因芯片以及LAMP 等多種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法, 使該病的診斷方法日益完善[8]。IHA操作簡(jiǎn)便，敏感性高，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可用于輔助診斷及作為流行病學(xué)調(diào)查和綜合查病的方法[9]。崔平等[10]以弓形蟲(chóng)P30 基因?yàn)镻CR 引物, 可以檢測(cè)出5 個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子的DNA，并且可在病豬的肝臟、肺臟、肺門淋巴結(jié)、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、腹水的DNA 樣品中檢測(cè)出弓形蟲(chóng)，該方法特異性較好。而本文也是根據(jù)弓形蟲(chóng)P30的保守區(qū)設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該同樣是比較可靠的。

本文所采用的兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性對(duì)照均較好，所有樣品檢測(cè)結(jié)果完全一致，達(dá)到了相互印證的目的，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，提示樹(shù)鼩可能自然不感染弓形蟲(chóng)，或者有可能是感染率極低所造成，這方面尚需以后做進(jìn)一步的研究。

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Infection investigation ofToxoplasmagondiiin tree shrews from various sources

TONG Pin-fen, WANG Wen-guang, KUANG De-xuan, Zhang Yuan, SUN Xiao-mei, DAI Jie-jie

(Center of Tree shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118, China)

Objective To investigate the infection status ofToxoplasmagondiiin different colonies of tree shrews and then provide the basis for parasitological monitoring. Methods Each of the forty blood samples were randomly collected from three tree shrews colonies: wild origin, domesticated and first generation, respectively. Both indirect hemagglutination test (IHA) and PCR assay were used to detect theToxoplasmagondii. Results No positive sample ofToxoplasmagondiiwas detected from either IHA or PCR results. The results from IHA and PCR assays were in coincidence with each other. Conclusions According to the survey none of the tree shrews from the three groups is infected withToxoplasmagondii. More samples or infection experiments are needed to determine whether tree shrews can be infected withToxoplasmagondii.

Tree Shrews;Toxoplasmagondii; Infection; Indirect hemagglutination Test; PCR

國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (2011BAI15B01-21；2012BAI39B01；2014BAI01B01)；云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)(2013DA002)。

仝品芬(1967-)女，主管技師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育研究。E-mail： tpf@imbcams.com.cn。

代解杰(1961-)男，研究員，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人,E-mail： djj@imbcams.com.cn。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0028-03

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.007

2014-05-27