張小飛，劉 冉,2，崔曉霞，馬 帥，張西臣，白杰英

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071；2.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100081；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062)

研究報告

旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后細(xì)胞因子變化比較分析

張小飛1，劉 冉1,2，崔曉霞1，馬 帥1，張西臣3，白杰英1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071；2.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100081；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062)

目的 比較旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后兩種動物免疫狀態(tài)的變化，建立適合感染寄生蟲的動物模型。方法 用旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后，通過檢測血細(xì)胞生理值、脾臟 IL-2蛋白濃度和脾臟 IL-6基因表達(dá)水平，分析兩種動物在感染旋毛蟲前后免疫應(yīng)答水平及免疫調(diào)控狀態(tài)的變化。結(jié)果 黑線倉鼠在感染旋毛蟲后免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的水平高于白化突變系，反應(yīng)程度更加劇烈。結(jié)論 黑線倉鼠是旋毛蟲感染的較為適宜的模型動物。

旋毛蟲；黑線倉鼠；白化突變系；細(xì)胞因子

旋毛蟲病是世界重要的食源性寄生蟲人畜共患病。人旋毛蟲病大多是由于吃了帶有旋毛蟲的生肉引起的，往往出現(xiàn)嚴(yán)重病癥，有的能引起死亡[1]。據(jù)王中全等[2]報道，目前我國人旋毛蟲病的暴發(fā)次數(shù)及發(fā)病人數(shù)與20世紀(jì)80～90年代相比有所下降，可能與旋毛蟲感染率的降低、肉檢工作的加強(qiáng)有關(guān)。人感染旋毛蟲后大部分臨床癥狀都是非特異性的，所以抗體檢測對旋毛蟲病的診斷具有重要意義。旋毛蟲的發(fā)育包括新生幼蟲、肌幼蟲和成蟲3個階段，產(chǎn)生的抗原具有非常顯著的期特異性[3]，旋毛蟲的宿主免疫系統(tǒng)對不同發(fā)育階段的旋毛蟲有著不同的免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)作用，參與人體多種重要的生理功能。外來病原感染機(jī)體后，體內(nèi)細(xì)胞因子存有量與部分功能將發(fā)生特異性變化。

黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)俗稱中國地鼠(Chinese hamster)，對許多致病細(xì)菌及病毒都具有高度的敏感性。如黑線倉鼠對白喉病比豚鼠更為易感，對結(jié)核菌的感染效果也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過小鼠，其癥狀和致病比豚鼠不僅早而且明顯。黑線倉鼠白化突變系是新培育的動物品種，與黑線倉鼠在生化指標(biāo)上有差異[4]，本實驗用旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系，分析比較兩者細(xì)胞因子變化，判斷機(jī)體免疫機(jī)能在感染前后的變化，建立最適旋毛蟲感染倉鼠模型。該模型將有助于深入了解感染宿主的免疫應(yīng)答水平及免疫調(diào)控狀態(tài)，對旋毛蟲病的臨床診治和免疫預(yù)防具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

黑線倉鼠和黑線倉鼠白化突變系(簡稱白化倉鼠)，體重(20～22)g，各18只(雌雄各半)，8周齡，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK-(軍)2007-004]， 實驗動物使用合格證號：[SYXK-(軍)2007- 005]。

1.2 儀器和材料

胃蛋白酶和IL-2 ELISA kit(上海西唐)； RNA(Qiagen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒( PrimeScript RT reagent kit )、SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)；DNAMarker2000(康為世紀(jì))；Real Time PCR 擴(kuò)增儀( Bio- Rar iQTM5)；血液分析儀。旋毛蟲獲贈于吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院張西臣教授。

1.3 實驗方法

1.3.1 旋毛蟲制備及感染：取旋毛蟲感染的小鼠全身肌肉，剪碎后用蛋白酶消化液消化，37℃，18 h。細(xì)胞篩過濾，37℃中沉淀1 h，棄去上部約2/3的液體，加3倍以上經(jīng)過預(yù)熱的生理鹽水稀釋。37℃中沉淀1 h，棄去上部約3/4的液體。重復(fù)洗3次，把最后剩下的液體用100目細(xì)胞篩過濾，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，獲得旋毛蟲脫囊幼蟲，加細(xì)胞培養(yǎng)液至濃度為100條/100 μL。

黑線倉鼠和白化倉鼠均分為8組，每組2只，1～8組灌胃300條旋毛蟲，9組灌胃生理鹽水，感染后第3、5、7天、第2、3、4、5、6周采集黑線倉鼠和白化倉鼠的抗凝血和脾臟保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血液生理值測定：本次實驗運用小鼠專用的血細(xì)胞分析儀測定，實驗材料取自實驗倉鼠的抗凝血。

1.3.3 脾臟IL-2 ELISA檢測：用來自上海西唐生物科技有限公司的白介素-2ELISA試劑盒，實驗采用雙抗夾心-ELISA法。用抗小鼠IL-2單抗包被與酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中得IL-2與單抗相結(jié)合，加入生物素化的抗小鼠IL-2，形成免疫復(fù)合連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的streptavidin與生物素相結(jié)合，加入底物工作液后顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本中IL-2的濃度。

1.3.4 脾臟IL-6基因QRT-PCR檢測：使用QIAGEN RNA kit提取黑線倉鼠與白化突變系脾臟總RNA，電泳檢測其完整性，并使用ND2100 微量核酸蛋白測定儀測定核酸濃度和純度。

反轉(zhuǎn)錄體系：5× PrimeScriptTM buffer 4 μL，PimeScript RT Enzyme Mix 1. 0 μL，Oligo (dT) primer 1.0 μL， 隨機(jī)引物1.0 μL， Total RNA 2 μL，DEPC水加至20 μL。反應(yīng)條件: 37℃ 30 min，85℃ 7 s，4℃ 保存。

根據(jù)Genbank上黑線倉鼠IL-6的DNA序列(序列號AF044667.1)設(shè)計引物，內(nèi)參為β-actin。CIL-6上下游引物序列為5′-TTG GGA AAT TTG CCT ACT GAA-3′和5′-GTT TTG GTG GTG CTC TGA ATG AC-3′；β-actin上下游引物序列為 5′-AGT GTC CCA ACA TCC CAG C-3′和5′-GTG ACA CCG TCC CCA GAA T-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度149 bp。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以黑線倉鼠與白化突變系脾臟組織的 cDNA 為模板，按照3倍梯度稀釋5個濃度標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行QRT-PCR擴(kuò)增(表1)。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系Tab.1 Reaction system of the real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 血液生理值結(jié)果

實驗對血液生理值的4個指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，分別是白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，黑線倉鼠在感染后自第3天開始，WBC與LYM這兩數(shù)值均高于同時期的被感染的白化黑線倉鼠；EOS曲線，黑線倉鼠與白化黑線倉鼠在第5天、第2、第6周時數(shù)值基本相等；EOS%曲線中，二者百分比值在第5天、第3周處基本持平，黑線倉鼠的嗜酸性粒細(xì)胞含量在感染第3天時達(dá)到峰值。

同時比較黑線倉鼠和白化倉鼠感染前后白細(xì)胞計數(shù)和淋巴細(xì)胞的數(shù)值變化，白化黑線倉鼠與黑線倉鼠在感染后1周時，與感染前相比，白細(xì)胞含量有明顯增高，淋巴細(xì)胞在前3周明顯增加。

2.2 脾臟IL-2 ELISA結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，IL-2濃度計算方程為y=(A - D) / [1 + (x/C)^B] + D(A=3.83758；B=-1.93713；C=18.43249；D=0.07703；r2=0.99590)。血清IL-2含量的變化如圖2所示，在感染后第2周降低，從第二周后含量持續(xù)增長，黑線倉鼠和白化黑線倉鼠變化趨勢相同，但黑線倉鼠的IL-2整體水平均高于白化黑線倉鼠。

A：白細(xì)胞數(shù)量；B：淋巴細(xì)胞數(shù)量；C：嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量；D：嗜酸性粒細(xì)胞百分比圖1 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后血液生理變化 A：WBC number；B：LYM number；C：EOS number；D：EOS%Fig.1 Changes of blood physiology of the Cricetulus barabensis and the albino mutant infected with Trichinella spiralis

左圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線；右圖為IL-2濃度曲線圖2 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟IL-2含量變化 Left: Standard curve; Right: IL-2 levelFig.2 Changes of IL-2 levels in the spleen of Cricetulus barabensis and the albino mutant infected with Trichinella spiralis

2.3 脾臟IL-6 QRT-PCR結(jié)果

提取的RNA用ND2000微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度A260/A280。各組樣品A260/A280的值在1.8～2.0之間，純度較好。如圖3和圖4所示，IL-6與cβ-actin的擴(kuò)增曲線均較為平滑，沒有出現(xiàn)非正常的數(shù)值偏移，二者融解曲線中在85℃時均有一峰出現(xiàn)，且都為單一峰，判斷為目的峰，圖5中可以看出，二者的cβ-actin數(shù)值均較為平穩(wěn)，黑線倉鼠的IL-6的含量自第3天開始至6周均為有規(guī)律的上下波動，白化黑線倉鼠的IL-6含量前3周有明顯降低，自第3周起開始回升，第6周IL-6含量明顯增加。

左圖為融解曲線；右圖為IL-6擴(kuò)增曲線圖3 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟IL-6 QRT-PCR反應(yīng) Left: Dissociation curves; Right: Amplification plots for IL-6Fig.3 IL-6 QRT-PCR reaction in the spleen of the Cricetulus barabensis and albino mutant infected with Trichinella spiralis

左圖為融解曲線；右圖為β-actin擴(kuò)增曲線圖4 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟β-actin QRT-PCR反應(yīng) Left: Dissociation curves; Right: Amplification plots for β-actinFig.4 β-actin QRT-PCR reaction in the spleen of Cricetulus barabensis and albino mutant infected with Trichinella spiralis

圖5 黑線倉鼠(B)及其白化突變系(W)感染旋毛蟲后脾臟IL-6變化曲線Fig.5 Changes of IL-6 in the spleen of Cricetulus barabensis (B) and the albino mutant (W) infected with Trichinella spiralis

3 討論

血液生理值檢測是判斷宿主動物是否感染寄生蟲的有效方法，同時可以反映機(jī)體全身免疫水平的變化。白細(xì)胞升高最常見原因是細(xì)菌感染，白細(xì)胞低說明免疫低下，極易感染各種病毒和細(xì)菌。劉向東研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲感染早期(第7天)蟲體周圍以嗜酸性粒細(xì)胞為主，感染3周出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤[5]。外周血EOS含量增加是寄生蠕蟲感染，特別是組織內(nèi)寄生蠕蟲感染時普遍存在的反應(yīng)[6]。EOS必須在免疫血清存在的情況下才能發(fā)揮殺傷作用，免疫血清中的免疫分子補(bǔ)體和免疫球蛋白在其中發(fā)揮了重要作用[7]。楊樹國等[8]發(fā)現(xiàn)小鼠外周血中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞于第14 天后逐漸上升趨勢，21 d、28 d 達(dá)高峰，后逐漸下降。我們的研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞計數(shù)在倉鼠感染旋毛蟲1周后與感染前有明顯差異，白細(xì)胞總數(shù)升高，而淋巴細(xì)胞數(shù)值也在倉鼠感染旋毛蟲3周時與感染前差異最為明顯。通過圖1可以看出倉鼠在感染旋毛蟲后約在2周左右時生理值變化最為明顯，其中白細(xì)胞計數(shù)以及淋巴細(xì)胞數(shù)值變化最為快速。與小鼠研究相比，黑線倉鼠感染旋毛蟲后免疫細(xì)胞變化的峰值出現(xiàn)時間比小鼠更早，表明不同品系動物在免疫細(xì)胞的激活時間上有差異。

CD4+輔助細(xì)胞分為兩種不同的效應(yīng)群[9]，Th1主要增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)作用，IL-2、IL-1β是Th1的重要細(xì)胞因子，Th2主要增強(qiáng)體液免疫作用，代表因子是IL-6。IL-1能激活胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，表達(dá)IL-2受體，分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、INF-γ等，同時也是前炎性因子[10]。IL-2能夠直接影響的維持細(xì)胞免疫功能的重要細(xì)胞因子，在宿主感染旋毛蟲后的免疫反應(yīng)中具有重要作用。在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有非常重要的作用，是一種免疫增強(qiáng)劑，具有抗病毒、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能等作用[11]。

張光玉等[12]發(fā)現(xiàn)小鼠感染旋毛蟲后1～5周IL-2的含量較正常組明顯增加，且IL-2的含量呈下降趨勢，至感染第6周時已基本降至正常水平。但我們研究卻發(fā)現(xiàn)，黑線倉鼠及其白化突變系動物感染旋毛蟲后，IL-2的含量從第2周至第6周呈上升趨勢，表明黑線倉鼠的免疫反應(yīng)性與小鼠有較大差異，不同動物對寄生蟲的敏感性不同，黑線倉鼠及其白化突變系動物在旋毛蟲移行至肌肉形成包囊的過程中，機(jī)體仍持續(xù)性分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)抵抗力。

IL-6又稱B細(xì)胞刺激因子，是一種具有多種生物學(xué)活性的多效性細(xì)胞因子，包括刺激B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞分化，激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白(APP)而改變一系列在急性炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的肝源性血清蛋白的濃度，幾乎能影響免疫系統(tǒng)的所有細(xì)胞，主要誘導(dǎo)活化后期的B細(xì)胞，此IL-6在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。本試驗應(yīng)用SYBR green實時熒光定量技術(shù)以黑線倉鼠基因序列為靶基因設(shè)計了IL-6的引物，成功建立了黑線倉鼠和白化黑線倉鼠細(xì)胞因子快速定量檢測方法。

對旋毛蟲感染白化黑線倉鼠機(jī)體免疫水平的研究表明，該動物對寄生蟲敏感，可作為旋毛蟲病的感染動物模型應(yīng)用，而且黑線倉鼠的免疫反應(yīng)性比其白化突變系動物更高。該模型的成功建立，不僅對旋毛蟲這類寄生蟲病的預(yù)防、提早發(fā)現(xiàn)和診斷提供參考，而且還可以為后續(xù)的寄生蟲病方面的深入研制以及相關(guān)藥物研發(fā)提供幫助，未來具有較為廣闊的發(fā)展空間。

[1] 叢恕增. 旋毛蟲病綜述 [J]. 中國獸醫(yī)雜志, 1985, 06:46-49.

[2] 王中全, 崔晶. 旋毛蟲排泄分泌抗原的研究進(jìn)展 [J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2003, 25(2):155-158.

[3] 崔晶, 王中全, 張璽,等. Ts21基因在旋毛蟲不同期蟲體的表達(dá)及特性的研究 [J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2009, 11:1057-1060.

[4] 趙爽, 王冬平, 劉曉, 等. 黑線倉鼠及其白化突變系血液生理生化值的測定與分析 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(7):17-21.

[5] 劉向東, 唐紅煒, 王淑強(qiáng). 旋毛蟲感染小鼠肌組織的病理研究 [J]. 河北北方學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2007, 01:17-19.

[6] 閆玉文, 李鵬, 邢杰, 等. 中性粒細(xì)胞體外殺傷旋毛蟲肌幼蟲的實驗觀察 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 6(4):379-381.

[7] 邢杰, 董錚, 馬萍, 等. IgE在小鼠旋毛蟲感染急性期免疫反應(yīng)中的作用 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 10(12):1372-1376.

[8] 楊樹國, 鐘萍, 張光玉, 等. 旋毛蟲在小鼠體內(nèi)的發(fā)育及炎性細(xì)胞反應(yīng)的動態(tài)觀察 [J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2012, 12(5):530-532.

[9] Constants L, Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD4+T cell responses: the alternative approaches [J]. Annu Rev Immunol, 1997, 15(3):297-322.

[10] 王婷, 鄭長青. 細(xì)胞因子在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中的作用 [J]. 世界華人消化雜志, 2005, 13 (1):72-75.

[11] Arai S, Tsuji M, Kim SJ, et al. Babesia canis infection in canine-red blood cell-substituted CID mice [J]. Int J Parasitol, 1998, 28(9):1429-1435.

[12] 張光玉, 王云甫, 黃朝芬, 等. IL-2對小鼠旋毛蟲感染的影響 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 6(5):542-543.

Changes of cytokines in theCricetulusbarabensisand their albino mutant infected withtrichinellaspiralis

ZHANG Xiao-fei1, LIU Ran1,2, CUI Xiao-xia1, MA Shuai1, ZHANG Xi-chen3, BAI Jie-ying1

(1. Laboratory Animal Center, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China;2. College of Biotechnology, Beijing City University, Beijing100081, China;3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062)

Objective To explore the differences in immune responses betweenCricetulusbarabensisand their albino mutant infected withTrichinellaspiralis. Methods The physiological parameters of blood, expression levels of IL-2 protein and IL-6 gene in the spleen were analyzed. Results The level of immune cells and cytokines ofCricetulusbarabensiswas higher than that in the albino mutant. ConclusionsCricetulusbarabensisis a suitable model animal for research on long-term latent infection such as infection withTrichinellaspiralis.

Trichinellaspiralis；Cricetulusbarabensis；Albino mutant；Cytokines

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新基金(2012CXJJ022)，動物中心青年基金(QN2011005)，“十二五”重大項目(2011zxj09201-031)。

張小飛(1979-)，女，實驗師。E-mail: 15810074189@163.com。

白杰英(1977-)，男，副研究員，主要從事實驗動物免疫與生物化學(xué)研究。E-mail: baijieying@126. com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0011-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.003

2014-05-22