李滿元 劉衛(wèi)東 許崇波

腹瀉腺病毒檢驗方法臨床應(yīng)用

李滿元 劉衛(wèi)東 許崇波

目的 腹瀉腺病毒檢驗方法臨床應(yīng)用。方法 免疫層析法對錦州兒童醫(yī)院及錦州地區(qū)腹瀉患者進行腺病毒檢測, 并對全部陽性標(biāo)本及100陰性標(biāo)本采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法特異性確認(rèn)。結(jié)果 標(biāo)本632例陽性標(biāo)本為24例, 陽性率3.79%。PCR陽性結(jié)果全部符合, 陰性標(biāo)本其中1份為陽性。結(jié)論 免疫層析法檢測腺病毒, 具有快速, 特異性高, 操作簡便, 對實驗室和工作人員條件要求低, 適合基層醫(yī)院廣泛開展。

腺病毒 檢測方法 免疫層析 PCR

腺病(adenovirus, ADV)是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的重要病原體, 腺病毒, 已經(jīng)確認(rèn)其可導(dǎo)致呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等多個系統(tǒng)與器官的感染, 臨床有一定癥狀表現(xiàn)［1］。ADV造成腹瀉主要是40和41型［2］, 有報道是僅次于輪狀病毒腹瀉病毒,主要感染兩歲以下兒童, 傳播途徑呼吸道傳播, 也有經(jīng)糞- 口途徑或有人與人的接觸傳播［3］。腸道腺病毒感染高峰期位于5 月～6月和9月～11月［4］。為了解錦州地區(qū)腺病毒感染情況, 開展腺病毒免疫層析法檢驗,并對陽性標(biāo)本進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進行特異性確認(rèn),以期待能在臨床廣泛應(yīng)用。特報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集錦州市兒童醫(yī)院2013年1月～2013年6月門診腹瀉患者316例, 年齡4～60個月, 男女不限。按照留取糞便要求留取糞便, 直接接入干凈無污染的容器內(nèi), 不得在紙尿褲或尿布中刮取。

1.2主要試劑 免疫層析法：檢測卡, 樣品稀釋管廠家北京萬泰。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法：DNA 提取液, PCR反應(yīng)管, DNA濃縮液, ADV強陽性質(zhì)控品, 陰性質(zhì)控品。廠家中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3主要設(shè)備 離心機, 杭州博日實時熒光定量PCR儀等。

1.4方法

1.4.1免疫層析 ①旋開滴管, 取出采便勺, 從糞便中取一勺糞便, 放入稀釋液中, 旋緊滴管。②混勻標(biāo)本, 折斷滴管蓋帽。③測試卡平鋪在干燥平面。④垂直緩滴2～3滴混勻樣品至測試卡加樣中心。⑤5～10 min內(nèi)判斷結(jié)果, 結(jié)果不可以超過10 min。

1.4.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法

1.4.2.1標(biāo)本處理 取少量糞便加入1 ml滅菌生理鹽水,充分震蕩混勻, 擠干棉拭子, 取100 μl上清至1.5 ml離心管中,加入100 μl濃縮液混勻, 12000 rpm離心10 min。

1.4.2.2陰性質(zhì)控品,陽性質(zhì)控品處理 取陰陽性質(zhì)控品, 8000 rpm離心數(shù)秒, 吸50 μl～0.5 ml滅菌離心管中, 加入50 μl DNA提取液充分混勻, 100℃恒溫處理10 min。12000 rpm離心5 min。

1.4.2.3PCR擴增 取ADV-PCR反應(yīng)管若干, 分別加入處理后上清液(含病毒DNA)各2 μl, 8000 rpm離心1 min。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的孔樣品槽內(nèi), 按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性定量質(zhì)控參考品梯度以及未知標(biāo)本, 并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團種類和循環(huán)條件:93℃→2 min預(yù)變性,然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s,先做10個循環(huán), 最后按93℃ 30 s→55℃ 45 s,做30個循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件, 最后運行程序。

2 結(jié)果

2.1免疫層析檢測結(jié)果 5歲以下男患者320例患者陽性標(biāo)本為13例, 陽性比率4.06%。5歲以下女患者312例, 陽性標(biāo)本為11例, 陽性比率3.52%?？傆?32例標(biāo)本, 其中陽性標(biāo)本為24例, 陽性標(biāo)本比率3.79%, 見表1。

表1免疫層析檢測結(jié)果

2.2PCR檢驗結(jié)果 對24份保留陽性標(biāo)本進行檢測, 全部為陽性。對100份陰性標(biāo)本進行檢測其中1份為陽性。

3 討論

腹瀉為嬰兒常見病, 多發(fā)病。腹瀉病毒學(xué)檢測臨床一直以輪狀病毒為主, 其他病毒檢測需要培養(yǎng), 兒童患者病情變化快, 無法等檢驗結(jié)果出來, 開始進行經(jīng)驗治療, 影響治療效果, 長期以來會造成病毒耐藥性產(chǎn)生。

本次結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADV感染的腺病毒腹瀉患者陽性患者多為排泄量較少, 往往伴有發(fā)熱腹瀉和腹痛。

本次實驗證明腺病毒造成臨床腹瀉與以上兩個亞型有關(guān)。腺病毒腹瀉與性別無關(guān), 與年齡相關(guān)性不大。

［1］ 全軍傳染病專業(yè)委員會, 新突發(fā)傳染病中西醫(yī)臨床救治課題組.腺病毒感染診療指南.解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(7):529-534.

［2］ 黃燕燕, 鄭曉群, 彭穎, 等.浙江溫州地區(qū)腹瀉患兒腺病毒的檢測及分型, 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2009, 19(1):24-25.

［3］ 王芳, 韋統(tǒng)友, 張廣蘭.嬰幼兒秋冬季腹瀉病毒感染的流行特點分析.衛(wèi)生職業(yè)教育, 2012, 30(20):109-111.

［4］ 張現(xiàn)娥, 李丹地, 李響.等, 長春地區(qū)2010年度嬰幼兒腹瀉的病原學(xué)研究及流行病學(xué)特點.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012, 26(11):26.

121000 錦州市婦嬰醫(yī)院(李滿元)；大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院(李滿元 劉衛(wèi)東 許崇波)；錦州市緊急醫(yī)療救援中心(劉衛(wèi)東)