劉帥峰

·臨床醫(yī)學(xué)·

Livin基因在Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

劉帥峰

目的 探討組織Livin mRNA表達(dá)在直腸癌病理分期Ⅱ、Ⅲ期的差異性, 并對(duì)其臨床意義進(jìn)行分析。方法 選取本院收治的Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者各30例, 行外科根治術(shù)；取術(shù)后病理組織及周邊健康組織, 分別以RT-PCR的方法檢測Livin mRNA的陽性表達(dá)率, 對(duì)比其差異性；同時(shí), 結(jié)合腫瘤體積、病理形態(tài)、Dukes分期、進(jìn)展情況及患者預(yù)后等情況分析該差異表達(dá)基因所代表的臨床意義。結(jié)果 Ⅱ期直腸癌患者病理組織及周邊健康組織的Livin mRNA陽性表達(dá)率分別為63.3%、6.67%,Ⅲ期直腸癌患者相應(yīng)數(shù)據(jù)為86.7%、10%；兩組患者病理組織Livin mRNA陽性表達(dá)率均顯著高于周邊健康組織(P＜0.05), 且Ⅲ期患者病理組織Livin mRNA陽性表達(dá)率顯著高于Ⅱ期患者病理組織(P＜0.05)。Livin mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度及患者術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P＜0.05), 而與其大小、病理形態(tài)及Dukes分期無顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。結(jié)論 Livin 可能通過激活腫瘤細(xì)胞的分化過程發(fā)揮致癌活性, mRNA呈陽性表達(dá)患者的腫瘤細(xì)胞可能具備更高的分化能力和術(shù)后復(fù)發(fā)率。

Livin；mRNA表達(dá)；直腸癌；病理分期；臨床意義

直腸癌在發(fā)病率和致死率上均居于各惡性腫瘤前列, 據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示, 其發(fā)病年齡日趨年輕化, 發(fā)病群體日趨多極化, 已逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展道路上有待解決的緊迫問題之一。Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成員之一, 在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等惡性腫瘤中均有高表達(dá)現(xiàn)象［1-3］。本實(shí)驗(yàn)以直腸癌為研究重點(diǎn), 探討Livin mRNA表達(dá)在直腸癌Ⅱ、Ⅲ期的差異性及其臨床意義, 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院收治的Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者各30例, 所有患者均行擇期外科根治術(shù)。兩組患者在年齡、性別及腫瘤Dukes分期等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.1.1Ⅱ期：男14例, 女16例, 年齡33～72歲, 平均(57.4±14.7)歲。分化程度：低分化7例；中分化13例；高分化10例。Dukes分期：A期4例；B期11例；C期9例；D期6例。

1.1.2Ⅲ期：男15例, 女15例, 年齡31～71歲, 平均(57.7±15.9)歲。分化程度：低分化4例；中分化12例；高分化14例。Dukes分期：A期5例；B期10例；C期8例；D期7例。

1.2主要儀器 低溫超速離心機(jī)(Beckman, XL90)；葡聚糖凝膠電泳及其配套裝置(北京六一儀器廠,DYY-4)；全自動(dòng)紫外-可見分析裝置(上海復(fù)日, FR200)；Mastercycler pro梯度PCR儀(eppendorf, Mastercycler pro)；微量電動(dòng)組織勻裝器(美國KIMBLE, 749540)；核酸蛋白測定儀(Eppendorf 公司, Biophotometerplus)等。

1.3主要試劑

1.3.1RNA提?。嚎俁NA提取試劑盒提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司, NEP019-1)；氯仿、無水乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3.2RT試劑：Oligod (T)18 primers (TaKaRa 公司, D511)；M-MLV RT (Promega 公司, M1701 )；Ribonuclease Inhibitor (TaKaRa 公司, D2313A)；10 mmol dNTP Mixture (TaKaRa公司, D4030RA)；DEPC (Sigma 公司)等。

1.3.3PCR試劑：2.5 mmol dNTP Mixture (TaKaRa公司, D4030A)；rTaq酶 (TaKaRa公司, DRIOOA)；DL500marker (TaKaRa公司, DL )等。

1.3.4凝膠電泳試劑：瓊脂糖(BIOWEST, 91622)；DNA green (北京天恩澤, 70303)等。

1.4研究方法

1.4.1RT-PCR方法 以總RNA提取試劑盒提取組織mRNA,使用Mastercycler pro梯度PCR儀自動(dòng)完成常規(guī)反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增過程, 各反應(yīng)體系依據(jù)產(chǎn)品說明書設(shè)定。

反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 30 min；82℃ 5 min。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min預(yù)變性；(94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s)32循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增后所得產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠(含DNA green)電泳, 穩(wěn)壓100 V, 電泳40～50 min, 以全自動(dòng)紫外-可見分析裝置觀察, 計(jì)算相對(duì)光度值。基因引物序列見表1。

1.4.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得Livin mRNA陽性表達(dá)數(shù)據(jù)均以率或構(gòu)成比表示, 以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0行χ2檢驗(yàn), 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：α=0.05, P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Ⅱ、Ⅲ期患者的Livin mRNA表達(dá)陽性率比較 兩組患者病理組織Livin mRNA陽性表達(dá)率均顯著高于周邊健康組織(P＜0.05), 且Ⅲ期患者病理組織Livin mRNA陽性表達(dá)率顯著高于Ⅱ期患者病理組織(P＜0.05)。見表2。

2.2Livin mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤情況及患者預(yù)后的關(guān)系 Livin mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度及患者預(yù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P＜0.05), 而與其大小、病理形態(tài)及Dukes分期無顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。見表3。

表1引物序列

表2Ⅱ、Ⅲ期患者的Livin mRNA表達(dá)陽性率結(jié)果統(tǒng)計(jì)(n, %)

表3Livin mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤情況及患者預(yù)后的關(guān)系(n, %)

3 討論

隨著惡性腫瘤研究領(lǐng)域的擴(kuò)展及研究層次的遞進(jìn), 其分子生物學(xué)機(jī)制得到進(jìn)一步挖掘；當(dāng)前研究表明, 細(xì)胞無限制增殖和生長的異常行為過程是惡性腫瘤生成和進(jìn)行性發(fā)展的重要條件, 凋亡因子及凋亡抑制因子的共調(diào)節(jié)在這一過程中起決定性作用［4］。Livin為近年發(fā)現(xiàn)的新型抗凋亡蛋白, 屬IAP家族成員之一, 基于其在多種惡性腫瘤中的廣泛性表達(dá),迅速成為當(dāng)前癌癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。研究表明, Livin的相關(guān)抗凋亡機(jī)制主要集中于兩條途徑［5,6］：①直接抑制凋亡蛋白酶活性；②通過活化TAK1/JNK1及PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)阻止TNF-α和IL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示, 直腸癌患者病理組織的Livin mRNA陽性表達(dá)率顯著高于周邊健康組織；且Ⅲ期癌患者病理組織的Livin mRNA陽性表達(dá)率顯著高于Ⅱ期患者；提示Livin mRNA陽性表達(dá)率與直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。經(jīng)單因素分析, Livin mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度及患者預(yù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān), 而與其大小、病理形態(tài)及Dukes分期無顯著關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步提示Livin可能通過激活腫瘤細(xì)胞的分化過程發(fā)揮致癌活性；同時(shí), 也說明其mRNA呈陽性表達(dá)患者的腫瘤細(xì)胞可能具備更高的分化能力和術(shù)后復(fù)發(fā)率。

［1］ Chen H, Jin Y, Chen T, et al.The antitumor effect of human cord blood-derived dendritic cells modified by the livin α gene in lung cancer cell lines.Oncol Rep, 2013, 29(2):619-627.

［2］ Ye L, Li S, Ye D, et al.Livin expression may be regulated by miR-198 in human prostate cancer cell lines.Eur J Cancer, 2013, 49(3):734-740.

［3］ Liang YZ, Fang TY, Xu HG, et al.Expression of CD44v6 and Livin in gastric cancer tissue.Chin Med J (Engl), 2012, 125(17):3161-3165.

［4］ 崔陽陽,陸建波.Livin及其相關(guān)因子的最新研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述, 2012,18(5):651-653.

［5］ Zhu Z, Sun H, Ma G, et al.Bufalin Induces Lung Cancer Cell Apoptosis via the Inhibition of PI3K/Akt Pathway.Int J Mol Sci, 2012, 13(2):2025-2035.

［6］ 李辰生,王吉文.Livin抑制凋亡的作用機(jī)制及其與腫瘤治療的關(guān)系的研究進(jìn)展.中國普通外科雜志, 2013,22(1):104-108.

471000 鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院胃腸胰腺外科