郭永紅,張微思，何 容，羅曉莉，黃仕文，桂明英**

(1.云南省食用菌工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650223；2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農(nóng)技站，云南 硯山 663100)

〈栽培技術(shù)〉

正交法優(yōu)化新疆蘆葦根蘑菇液體培養(yǎng)基的研究*

郭永紅1,2,張微思1,2，何 容2，羅曉莉2，黃仕文3，桂明英2**

(1.云南省食用菌工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650223；2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農(nóng)技站，云南 硯山 663100)

本文采用液體培養(yǎng)法，研究新疆蘆葦根蘑菇對(duì)碳氮源的利用情況，并以四因素三水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基配方的優(yōu)化。結(jié)果表明，新疆蘆葦根蘑菇的最適培養(yǎng)基配方為糊精30 g·L-1、酵母粉2 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

新疆蘆葦根蘑菇；液體培養(yǎng)基；正交試驗(yàn)

新疆蘆葦根蘑菇，采自新疆郭音巴楞州博湖縣蘆葦蕩，該蘑菇具有營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、子實(shí)體大等特點(diǎn)，市場(chǎng)銷量逐年增加。為滿足人們的生活需要，開(kāi)發(fā)新疆蘆葦根蘑菇種質(zhì)資源已成為人們研究的新課題。通過(guò)實(shí)地采樣后對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行了組織分離，成功獲得斜面母種，并對(duì)其進(jìn)行了液體培養(yǎng)基的優(yōu)化。即從液體培養(yǎng)常用的幾種碳氮源中篩選出較優(yōu)者[1]，并采用正交試驗(yàn)的方法獲得碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽3種營(yíng)養(yǎng)成分之間的最合理搭配[2，3]，獲得蘑菇的最適液體培養(yǎng)基，為人工栽培提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

新疆蘆葦根蘑菇，分離自新疆郭音巴楞州博湖縣蘆葦蕩蘑菇。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH自然；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB10.01%，pH自然。各碳源、氮源不同的培養(yǎng)基分別取代其中的葡萄糖和蛋白胨，其余成分不變。配方見(jiàn)表1。

表1 液體培養(yǎng)基配方

1.2.1 斜面菌種制備

將新疆蘆葦蘑菇進(jìn)行組織分離，接種于斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7 d。

1.2.2 培養(yǎng)方法及條件

取2小塊1 cm2菌塊接種于液體培養(yǎng)基，使菌絲朝上懸浮于液體培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.3 菌絲體生物量的計(jì)算

過(guò)濾發(fā)酵液，清洗菌絲體出去殘留培養(yǎng)基，60℃烘箱烘干菌絲體至恒重，稱重并計(jì)算生物量(M，g·L-1)，公式為：

M=m1100×1000

式中：m1為100 mL發(fā)酵液中菌絲體干重。

綜上所述，國(guó)內(nèi)尿素走勢(shì)并不如意，開(kāi)工率下滑利好不斷被業(yè)內(nèi)炒作，或已透支；所謂的印度招標(biāo)利好也不及預(yù)期。不可否認(rèn)，當(dāng)前行業(yè)低開(kāi)工局面確實(shí)給低庫(kù)存或零庫(kù)存的尿素企業(yè)提供了挺價(jià)籌碼，但內(nèi)需疲軟，暫時(shí)不允許工廠去考慮“貨緊價(jià)揚(yáng)”。換而言之，或許淡儲(chǔ)期間的供應(yīng)量不及往年水平，下游經(jīng)銷商庫(kù)存量偏低，但并不能改變此時(shí)下游對(duì)高價(jià)尿素的不認(rèn)可。當(dāng)然，不排除眾多經(jīng)銷商在本輪尿素跌價(jià)期間等待新的抄底機(jī)會(huì)，但相應(yīng)心理價(jià)位仍需進(jìn)一步博弈。預(yù)計(jì)11月底，國(guó)內(nèi)尿素主產(chǎn)區(qū)報(bào)價(jià)2000元/噸左右。

1.2.4 最適碳氮源篩選試驗(yàn)

(1)最適碳源試驗(yàn)

分別以2%葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、果糖、糊精作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，按配方配制7組培養(yǎng)基，每組3個(gè)重復(fù)。

(2)最適氮源試驗(yàn)

分別以0.2%蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3作基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，按配方配7組培養(yǎng)基，每組3個(gè)重復(fù)。

將配好的培養(yǎng)基裝入500 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，121℃滅菌20 min。冷卻后接種，于25℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)情況，至菌絲最旺時(shí)稱量菌絲體干重。

1.2.5 正交試驗(yàn)

考慮碳氮比及無(wú)機(jī)鹽之間的交互作用對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響，選取最適碳氮源試驗(yàn)中得到的碳源和氮源，無(wú)機(jī)鹽采用KH2PO4、MgSO4·7H2O，維生素選擇VB1，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)。用L9(34)正交試驗(yàn)方法以發(fā)酵終點(diǎn)菌絲體干重為主要指標(biāo)，篩選4者之間的最優(yōu)搭配，每組設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源篩選結(jié)果

發(fā)酵終點(diǎn)稱量各供試培養(yǎng)基中菌絲體干重，計(jì)算出生物量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，蘑菇菌絲生長(zhǎng)能優(yōu)先利用的碳源為糊精，生物量為2.93 g·L-1；其次為乳糖、蔗糖、果糖；而該蘑菇對(duì)淀粉的利用率最差。最后，選擇糊精作為蘑菇生長(zhǎng)的最佳碳源來(lái)進(jìn)行氮源的篩選試驗(yàn)。

2.2 最適氮源篩選結(jié)果

發(fā)酵終點(diǎn)稱量各供試培養(yǎng)基中菌絲體干重，計(jì)算出生物量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為酵母粉，生物量高達(dá)3.61 g·L-1；其次為牛肉膏和尿素，生物量分別為 2.64 g·L-1、2.61 g·L-1；利用較差的為無(wú)機(jī)氮源，其中以NaNO3最差。表明該蘑菇在以有機(jī)氮源進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，菌絲體生物量產(chǎn)率明顯高于無(wú)機(jī)氮源，可見(jiàn)在其菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)有機(jī)氮源的利用優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，而對(duì)這幾種無(wú)機(jī)氮源的利用相差不大。最后選擇酵母粉作為蘑菇液體培養(yǎng)基的最佳氮源進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)基

以得到的最適碳源糊精作為碳源，最適氮源酵母粉作為氮源，以及無(wú)機(jī)鹽KH2PO4、MgSO4·7H2O作為正交試驗(yàn)四因素，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

根據(jù)極差大小，判斷因素的主次影響順序，R越大，表示該因素的水平變化對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，因素越重要。由表3可知，糊精對(duì)蘑菇菌絲的生長(zhǎng)影響最大，其次是無(wú)機(jī)鹽MgSO4·7H2O和酵母粉，KH2PO4對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響最小。各因素的主次順序?yàn)锳>D>B>C，A因素為主要因素，C因素為不重要因素。

進(jìn)一步考察各因子對(duì)指標(biāo)的影響，對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行了方差分析，見(jiàn)表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析

注：F0.10(2，8)=3.11。

從表4的方差分析結(jié)果可以看出，因素A在90%的置信度下的F比大于F0.10(2，8)，表明糊精對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響；因素B、C、D對(duì)試驗(yàn)影響不顯著。從極差分析和方差分析結(jié)果可以確定培養(yǎng)基的最佳組合為A3B3C2D1，即糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

3 結(jié)論

碳源試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳糖、蔗糖、果糖、糊精有利于蘑菇菌絲生長(zhǎng)，其中以糊精最好。

氮源試驗(yàn)表明，酵母粉、牛肉膏和尿素是蘑菇較適宜的發(fā)酵氮源，二無(wú)機(jī)氮源不利于菌絲體的生長(zhǎng)。

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果確定的蘑菇液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組分為糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

[1]劉東，李世敏，許柏球，等. 靈芝菌絲體深層液體培養(yǎng)基研究[J]. 微生物學(xué)雜志，2001，21(2)：15-17.

[2] 楊立紅，倪新江，黃清榮，等. 栽培基質(zhì)對(duì)巴西蘑菇胞外酶活性的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(6)：284-286.

[3] 王怡平，肖亞中，沈中興，等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)化食用菌深層發(fā)酵的泥炭培養(yǎng)基[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，20(2)：93-97.

Orthogonal Optimization of Liquid Medium of Xinjiang Reed Root Mushroom

GUO Yong-hong1,2, ZHANG Wei-si1,2, HE Rong2, LUO Xiao-li2, HUANG Shi-wen3, GUI Ming-ying2

(1.Edible Fungi Engineering Technology Research Center of Yunnan Province, KunmingYunnan650223; 2.Kunming Edible Fungi Institute of China Co-op, KunmingYunnan650223; 3.Agricultural Technician Station of Baga Counthy of Wenshan State, YanshanYunnan663100)

By liquid culture, Xinjiang reed root mushroom on the utilization situation of carbon and nitrogen source were studied, using orthogonal experiment with four factors and three levels for optimizating the formula of medium. The results showed that the optimal culture medium formula of Xinjiang reed root mushroom was dextrin 30 g·L-1, yeast extract 2 g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1, KH2PO40.25 g·L-1.

Agaricus; Liquid Medium; Orthogonal test

*項(xiàng)目來(lái)源：國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題“野生食用菌資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用技術(shù)研究”(2013BAD16B01)。

郭永紅(1964-)，女，研究員，主要從事食用菌資源保護(hù)及食用菌栽培技術(shù)研究。E-mail:guoyonghong@126.com

**通信作者：桂明英，研究員，主要從事食用菌資源的保護(hù)開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：guimingying@126.com

2013-11-24

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0017-03