重組雌激素受體基因酵母細(xì)胞檢測(cè)牛尿液中β—雌二醇?xì)埩舻姆椒?/h1>
2014-07-16 08:27:01陳劍等
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年3期
陳劍等
摘要：為探索畜禽產(chǎn)品中雌激素殘留的檢驗(yàn)方法，加強(qiáng)對(duì)畜禽生產(chǎn)過(guò)程中激素添加的監(jiān)控，本研究選擇了在我國(guó)幾種常見(jiàn)影響比較大的合成雌激素-β-雌二醇（E2）為研究對(duì)象，建立用于測(cè)定動(dòng)物尿液中雌激素的重組基因酵母檢測(cè)法。結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)單、有效，能夠作為雌激素殘留檢測(cè)體系的有益補(bǔ)充。
關(guān)鍵詞：畜禽產(chǎn)品；重組雌激素受體基因酵母細(xì)胞；牛尿液；雌激素；β-雌二醇；殘留檢測(cè)
中圖分類號(hào)： S852.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0166-02
生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的雌激素，可以通過(guò)食物鏈富集作用于人體，導(dǎo)致生殖障礙、出生缺陷、發(fā)育異常、代謝紊亂以及某些癌癥的發(fā)生[1]。世界很多國(guó)家計(jì)劃或已經(jīng)制定了一些法律法規(guī)限制此外類物質(zhì)的使用，譬如除己烯雌酚等人工合成類雌激素化合物于1980年華沙國(guó)際學(xué)術(shù)討論會(huì)和同年的聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織聯(lián)席會(huì)議決定全面禁用[2]。就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。隨著重組DNA技術(shù)、基因表達(dá)及酵母分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的外源基因在酵母細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，因此，酵母作為一個(gè)基因工程表達(dá)系統(tǒng)受到廣泛研究應(yīng)用[3]。通過(guò)本研究希望能夠?yàn)槲覈?guó)建立快速檢測(cè)牛生產(chǎn)中添加雌激素情況的監(jiān)測(cè)提供新技術(shù)支持、構(gòu)建我國(guó)畜禽安全生產(chǎn)的預(yù)警體系。
1 測(cè)定原理
將人類雌激素受體基因（hER cDNA）轉(zhuǎn)化于酵母，使其高效表達(dá)，再將雌激素反應(yīng)原件（ERE）與編碼β-半乳糖苷酶的LacZ報(bào)告基因相串聯(lián)，重組于酵母細(xì)胞。當(dāng)牛尿中的雌激素活性物質(zhì)與酵母中的hER結(jié)合后，會(huì)通過(guò)生物變構(gòu)效應(yīng)，經(jīng)雌激素效應(yīng)元件（ERE）順式激活Lac Z （β-半乳糖苷酶） 基因表達(dá)，從而使Lac Z的表達(dá)量增加。通過(guò)測(cè)定Lac Z的活性就可以定量反映牛尿中雌激素的含量。
2 試驗(yàn)材料
2.1 試驗(yàn)樣品采集
小牛尿液：從揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)采集出生10日齡的小牛尿液12份，依次編號(hào)分別為112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、125、128。
2.2 試驗(yàn)材料
C18柱（美國(guó)Welch公司）；甲醇（上海振興化工一廠，分析純）；丙酮、無(wú)水乙醇、濃鹽酸氫氧化鈉、二氯甲烷（上海焱晨化工實(shí)業(yè)有限公司，均為分析純）；瓊脂粉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；酵母基本合成配養(yǎng)基（SD）及無(wú)色氨酸、尿嘧啶（-Trp、-Ura）營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料原料（美國(guó)Clontech公司）；β-雌二醇（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院李湘鳴教授提供）。
3 試驗(yàn)過(guò)程
3.1 重組雌激素受體基因細(xì)胞酵母培養(yǎng)
3.1.1 培養(yǎng)板制作 按照配方配制選擇性固體培養(yǎng)平板SD/-trp、-ura （無(wú)色氨酸、尿嘧啶），經(jīng)121 ℃滅菌20 min，取約15 mL倒入消毒培養(yǎng)皿中，冷凝后用保鮮膜密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.1.2 重組雌激素受體基因酵母細(xì)胞（W303-1A/hER-ERE-LacZ）接種 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將W303-1A/hER-ERE-LacZ劃線接種于SD/-trp、-ura 平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d，使其長(zhǎng)出3～4 mm的酵母克隆，保鮮膜密封，4 ℃冰箱保存。
3.1.3 擴(kuò)增酵母克隆 取消毒玻璃瓶1只，加入3 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液，用接種環(huán)從SD/-trp、-ura 培養(yǎng)板挑取酵母克隆置于3 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液中，在30 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)過(guò)夜（約14 h）。
3.2 樣品預(yù)處理
用定性濾紙和漏斗將原尿過(guò)濾至干凈消毒玻璃瓶中。為減少誤差，用具塞試管分裝過(guò)濾牛尿至消毒玻璃瓶中，每樣2份，一份取5 mL做加樣試驗(yàn)，另一份取5 mL做空白對(duì)照。
3.3 試劑配制
（1） 8 mol/L NaOH （分子量40）：稱取NaOH 32 g，用 100 mL 雙蒸水充分溶解。（2） 0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG：取40 mg ONPG粉末，加入10 mL的Z Buffer，再加入溶菌酶使其終濃度為 0.1 mg/mL，避光充分混勻，分裝為2 mL/管，冷凍保存。
3.4 尿樣加標(biāo)
小牛尿液分別加入試驗(yàn)選擇的雌激素物質(zhì)：乙炔雌二醇。β-雌二醇做加標(biāo)后在小牛尿液中的終濃度達(dá)到0.050 mol/L?？瞻讓?duì)照（即尿樣空白）加入等量的乙醇；試劑空白用2 mL蒸餾水代替小牛尿液。
3.5 C18吸附柱活化
用移液器吸取2.5 mL甲醇淋洗C18吸附柱，每次 15 min，共3次，再用雙蒸水清洗3次，每次15 min，將活化后的吸附柱放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
3.6 水解
目的是將內(nèi)源性的結(jié)合性雌激素類化合物水解為游離型。分別取加標(biāo)尿液2 mL置于具塞試管中，依次加入2 mL HCl、2 mL甲醇；空白對(duì)照和試劑空白與尿樣完全相同。
將試管于100 ℃水浴作用1 h，然后吸取2 mL用 8 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至3.0。
3.7 吸附
將上述pH值為3.0水解液分別通過(guò)活化C18吸附柱，棄去流出液。在無(wú)液體流出后（吸附約20 min），用循環(huán)水式真空泵抽氣5 min，盡量除去C18吸附柱中殘留的水分。然后用4 mL二氯甲烷洗脫C18吸附柱2次，每次約30 min。將洗脫液洗置于消毒玻璃瓶中，封口編號(hào)。
4 雌激素類化學(xué)物測(cè)定
4.1 作用于酵母細(xì)胞
在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將每份試驗(yàn)?zāi)驑佑枚燃淄橄疵撘何?.1 mL至消毒玻璃瓶中，置于37 ℃烘箱內(nèi)，揮發(fā)5 min。加入1.5 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液，再加入0.5 mL過(guò)夜酵母培養(yǎng)液，使其在培養(yǎng)液中濃度分別為100、0 mg/mL（對(duì)照），30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h。
4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）。空白試劑中雌激素活性更低，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
參考文獻(xiàn)：
[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環(huán)境雌激素的研究現(xiàn)狀（二）——環(huán)境雌激素的測(cè)定[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009（2）：47-49.
[2]郁 倩. 動(dòng)物性食品和水中雌激素殘留污染檢測(cè)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.
[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細(xì)胞檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)污水中環(huán)境雌激素[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：2200-2205.
4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）?？瞻自噭┲写萍に鼗钚愿?，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
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4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）?？瞻自噭┲写萍に鼗钚愿?，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
參考文獻(xiàn)：
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[2]郁 倩. 動(dòng)物性食品和水中雌激素殘留污染檢測(cè)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.
[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細(xì)胞檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)污水中環(huán)境雌激素[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：2200-2205.
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陳劍等
摘要：為探索畜禽產(chǎn)品中雌激素殘留的檢驗(yàn)方法，加強(qiáng)對(duì)畜禽生產(chǎn)過(guò)程中激素添加的監(jiān)控，本研究選擇了在我國(guó)幾種常見(jiàn)影響比較大的合成雌激素-β-雌二醇（E2）為研究對(duì)象，建立用于測(cè)定動(dòng)物尿液中雌激素的重組基因酵母檢測(cè)法。結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)單、有效，能夠作為雌激素殘留檢測(cè)體系的有益補(bǔ)充。
關(guān)鍵詞：畜禽產(chǎn)品；重組雌激素受體基因酵母細(xì)胞；牛尿液；雌激素；β-雌二醇；殘留檢測(cè)
中圖分類號(hào)： S852.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0166-02
生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的雌激素，可以通過(guò)食物鏈富集作用于人體，導(dǎo)致生殖障礙、出生缺陷、發(fā)育異常、代謝紊亂以及某些癌癥的發(fā)生[1]。世界很多國(guó)家計(jì)劃或已經(jīng)制定了一些法律法規(guī)限制此外類物質(zhì)的使用，譬如除己烯雌酚等人工合成類雌激素化合物于1980年華沙國(guó)際學(xué)術(shù)討論會(huì)和同年的聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織聯(lián)席會(huì)議決定全面禁用[2]。就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。隨著重組DNA技術(shù)、基因表達(dá)及酵母分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的外源基因在酵母細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，因此，酵母作為一個(gè)基因工程表達(dá)系統(tǒng)受到廣泛研究應(yīng)用[3]。通過(guò)本研究希望能夠?yàn)槲覈?guó)建立快速檢測(cè)牛生產(chǎn)中添加雌激素情況的監(jiān)測(cè)提供新技術(shù)支持、構(gòu)建我國(guó)畜禽安全生產(chǎn)的預(yù)警體系。
1 測(cè)定原理
將人類雌激素受體基因（hER cDNA）轉(zhuǎn)化于酵母，使其高效表達(dá)，再將雌激素反應(yīng)原件（ERE）與編碼β-半乳糖苷酶的LacZ報(bào)告基因相串聯(lián)，重組于酵母細(xì)胞。當(dāng)牛尿中的雌激素活性物質(zhì)與酵母中的hER結(jié)合后，會(huì)通過(guò)生物變構(gòu)效應(yīng)，經(jīng)雌激素效應(yīng)元件（ERE）順式激活Lac Z （β-半乳糖苷酶） 基因表達(dá)，從而使Lac Z的表達(dá)量增加。通過(guò)測(cè)定Lac Z的活性就可以定量反映牛尿中雌激素的含量。
2 試驗(yàn)材料
2.1 試驗(yàn)樣品采集
小牛尿液：從揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)采集出生10日齡的小牛尿液12份，依次編號(hào)分別為112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、125、128。
2.2 試驗(yàn)材料
C18柱（美國(guó)Welch公司）；甲醇（上海振興化工一廠，分析純）；丙酮、無(wú)水乙醇、濃鹽酸氫氧化鈉、二氯甲烷（上海焱晨化工實(shí)業(yè)有限公司，均為分析純）；瓊脂粉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；酵母基本合成配養(yǎng)基（SD）及無(wú)色氨酸、尿嘧啶（-Trp、-Ura）營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料原料（美國(guó)Clontech公司）；β-雌二醇（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院李湘鳴教授提供）。
3 試驗(yàn)過(guò)程
3.1 重組雌激素受體基因細(xì)胞酵母培養(yǎng)
3.1.1 培養(yǎng)板制作 按照配方配制選擇性固體培養(yǎng)平板SD/-trp、-ura （無(wú)色氨酸、尿嘧啶），經(jīng)121 ℃滅菌20 min，取約15 mL倒入消毒培養(yǎng)皿中，冷凝后用保鮮膜密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.1.2 重組雌激素受體基因酵母細(xì)胞（W303-1A/hER-ERE-LacZ）接種 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將W303-1A/hER-ERE-LacZ劃線接種于SD/-trp、-ura 平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d，使其長(zhǎng)出3～4 mm的酵母克隆，保鮮膜密封，4 ℃冰箱保存。
3.1.3 擴(kuò)增酵母克隆 取消毒玻璃瓶1只，加入3 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液，用接種環(huán)從SD/-trp、-ura 培養(yǎng)板挑取酵母克隆置于3 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液中，在30 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)過(guò)夜（約14 h）。
3.2 樣品預(yù)處理
用定性濾紙和漏斗將原尿過(guò)濾至干凈消毒玻璃瓶中。為減少誤差，用具塞試管分裝過(guò)濾牛尿至消毒玻璃瓶中，每樣2份，一份取5 mL做加樣試驗(yàn)，另一份取5 mL做空白對(duì)照。
3.3 試劑配制
（1） 8 mol/L NaOH （分子量40）：稱取NaOH 32 g，用 100 mL 雙蒸水充分溶解。（2） 0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG：取40 mg ONPG粉末，加入10 mL的Z Buffer，再加入溶菌酶使其終濃度為 0.1 mg/mL，避光充分混勻，分裝為2 mL/管，冷凍保存。
3.4 尿樣加標(biāo)
小牛尿液分別加入試驗(yàn)選擇的雌激素物質(zhì)：乙炔雌二醇。β-雌二醇做加標(biāo)后在小牛尿液中的終濃度達(dá)到0.050 mol/L?？瞻讓?duì)照（即尿樣空白）加入等量的乙醇；試劑空白用2 mL蒸餾水代替小牛尿液。
3.5 C18吸附柱活化
用移液器吸取2.5 mL甲醇淋洗C18吸附柱，每次 15 min，共3次，再用雙蒸水清洗3次，每次15 min，將活化后的吸附柱放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
3.6 水解
目的是將內(nèi)源性的結(jié)合性雌激素類化合物水解為游離型。分別取加標(biāo)尿液2 mL置于具塞試管中，依次加入2 mL HCl、2 mL甲醇；空白對(duì)照和試劑空白與尿樣完全相同。
將試管于100 ℃水浴作用1 h，然后吸取2 mL用 8 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至3.0。
3.7 吸附
將上述pH值為3.0水解液分別通過(guò)活化C18吸附柱，棄去流出液。在無(wú)液體流出后（吸附約20 min），用循環(huán)水式真空泵抽氣5 min，盡量除去C18吸附柱中殘留的水分。然后用4 mL二氯甲烷洗脫C18吸附柱2次，每次約30 min。將洗脫液洗置于消毒玻璃瓶中，封口編號(hào)。
4 雌激素類化學(xué)物測(cè)定
4.1 作用于酵母細(xì)胞
在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將每份試驗(yàn)?zāi)驑佑枚燃淄橄疵撘何?.1 mL至消毒玻璃瓶中，置于37 ℃烘箱內(nèi)，揮發(fā)5 min。加入1.5 mL SD/-trp、-ura 培養(yǎng)液，再加入0.5 mL過(guò)夜酵母培養(yǎng)液，使其在培養(yǎng)液中濃度分別為100、0 mg/mL（對(duì)照），30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h。
4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）。空白試劑中雌激素活性更低，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
參考文獻(xiàn)：
[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環(huán)境雌激素的研究現(xiàn)狀（二）——環(huán)境雌激素的測(cè)定[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009（2）：47-49.
[2]郁 倩. 動(dòng)物性食品和水中雌激素殘留污染檢測(cè)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.
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4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）?？瞻自噭┲写萍に鼗钚愿?，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
參考文獻(xiàn)：
[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環(huán)境雌激素的研究現(xiàn)狀（二）——環(huán)境雌激素的測(cè)定[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009（2）：47-49.
[2]郁 倩. 動(dòng)物性食品和水中雌激素殘留污染檢測(cè)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.
[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細(xì)胞檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)污水中環(huán)境雌激素[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：2200-2205.
4.2 顯色
取透明酶標(biāo)板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內(nèi)顯色，記錄受試樣品的顯色時(shí)間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應(yīng)。同時(shí)以同樣的方法取透明酶標(biāo)板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養(yǎng)液，用于測(cè)波長(zhǎng)為 630 nm 處的細(xì)胞密度。
4.3 測(cè)光密度
用酶標(biāo)儀測(cè)光密度，于波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)顯色尿樣，波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)經(jīng)受試物作用的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。
5 結(jié)果與分析
5.1 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)
表1為重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇和小牛原尿的反應(yīng)變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產(chǎn)生明顯的響應(yīng)，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達(dá)1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）?？瞻自噭┲写萍に鼗钚愿?，說(shuō)明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。
5.2 重組基因酵母細(xì)胞對(duì)β-雌二醇的反應(yīng)分析
根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和研究分析，重組基因酵母細(xì)胞對(duì)加入β-雌二醇的小牛原尿的反應(yīng)明顯，所有加標(biāo)尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標(biāo)樣，說(shuō)明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態(tài)，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應(yīng)差別不大，但稍高于空白試劑，說(shuō)明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因?yàn)樾∨．吘故巧锘铙w，所產(chǎn)生的體液中還具有其他的生物活性物質(zhì)，因此與空白試劑相比，所測(cè)結(jié)果也可能是其他生物活性物質(zhì)的干擾性反應(yīng)。通過(guò)比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無(wú)明顯差別。
這次檢測(cè)的尿液樣本的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，利用酵母檢測(cè)雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過(guò)該驗(yàn)證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進(jìn)一步證實(shí)。選擇10日齡小牛尿作為試驗(yàn)對(duì)象是真實(shí)物質(zhì)載體，可以更好地說(shuō)明酵母細(xì)胞檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便的優(yōu)異性。
5.3 問(wèn)題與展望
雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)人體可產(chǎn)生多方面的作用。隨著工業(yè)的發(fā)展，雌激素的污染進(jìn)一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴(yán)重，將會(huì)有越來(lái)越多的物質(zhì)被懷疑具有雌激素效應(yīng)。但是就目前而言，對(duì)于環(huán)境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問(wèn)題有待進(jìn)一步揭示。因此，建立快速經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單有效的生物檢測(cè)方法就顯得尤為重要。發(fā)展出快速、簡(jiǎn)便的方法是國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者致力的研究目標(biāo)，并且已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但有效監(jiān)控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。
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