趙念力等

摘要：將引進(jìn)的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，相關(guān)生長(zhǎng)情況的試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在YMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快。在YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行的碳源利用試驗(yàn)表明，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中根瘤菌生長(zhǎng)得最好。按L9（34）正交設(shè)計(jì)表對(duì)YMA培養(yǎng)基中的4個(gè)組分比例進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析可得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補(bǔ)足至1 000 mL。

關(guān)鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個(gè)體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉(zhuǎn)化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況、提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經(jīng)成為世界各國(guó)豆科作物增產(chǎn)、減少化肥施用的一項(xiàng)技術(shù)措施，在許多國(guó)家都有大規(guī)模商品菌劑的生產(chǎn)和出售，應(yīng)用面積也不斷擴(kuò)大。隨著無(wú)公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展，接種高效大豆根瘤菌將產(chǎn)生更顯著的社會(huì)與環(huán)境效益[3]。俄羅斯對(duì)根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎(chǔ)并積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[4-5]。2009年黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從全俄大豆科學(xué)研究所引進(jìn)了十多個(gè)高效大豆固氮根瘤菌株，并結(jié)合黑龍江省的生態(tài)環(huán)境特點(diǎn)和大豆主栽品種進(jìn)行綜合研究、開發(fā)和應(yīng)用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，但其生長(zhǎng)較慢，不適合在生產(chǎn)上加以應(yīng)用，因此有必要研究、改良培養(yǎng)基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，提高大豆根瘤菌的培養(yǎng)速度。本研究主要通過(guò)優(yōu)化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養(yǎng)基，篩選出最適合根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，為實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為引進(jìn)的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學(xué)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)用培養(yǎng)基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（2）SM培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（3）TY培養(yǎng)基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0。（4）PA培養(yǎng)基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養(yǎng)基上28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d后接種到Y(jié)MA培養(yǎng)液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。

1.3.3 培養(yǎng)基的比較 在600 nm下測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗(yàn) 在培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基上進(jìn)行碳源的篩選試驗(yàn)。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養(yǎng)基中的甘露醇，同時(shí)保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養(yǎng)基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、24、36、48h時(shí)測(cè)定D600 nm。

1.3.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化 在常規(guī)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)大豆根瘤菌的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。進(jìn)行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設(shè)計(jì)方案對(duì)培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)5種培養(yǎng)基的篩選表明，YMA培養(yǎng)基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長(zhǎng)。碳源利用試驗(yàn)表明，葡萄糖為最優(yōu)碳源。正交試驗(yàn)得到GF菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補(bǔ)至1 000 mL。優(yōu)化的根瘤菌YMA培養(yǎng)基在避免資源浪費(fèi)和降低生產(chǎn)成本的前提下，實(shí)現(xiàn)了根瘤菌的大量、快速生長(zhǎng)，為根瘤菌工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[6]。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45（1）：57-61.

[2]譚 娟. 接種俄羅斯大豆根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響[J]. 作物雜志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)科技出版社，1994.

[4]張 武. 俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態(tài)適應(yīng)性[J]. 作物雜志，2010（3）：54-55.

[5]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（1）：50-53.

[6]吳紅慧，周俊初. 根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和劑型的比較研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（2）：14-19.

摘要：將引進(jìn)的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，相關(guān)生長(zhǎng)情況的試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在YMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快。在YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行的碳源利用試驗(yàn)表明，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中根瘤菌生長(zhǎng)得最好。按L9（34）正交設(shè)計(jì)表對(duì)YMA培養(yǎng)基中的4個(gè)組分比例進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析可得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補(bǔ)足至1 000 mL。

關(guān)鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個(gè)體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉(zhuǎn)化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況、提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經(jīng)成為世界各國(guó)豆科作物增產(chǎn)、減少化肥施用的一項(xiàng)技術(shù)措施，在許多國(guó)家都有大規(guī)模商品菌劑的生產(chǎn)和出售，應(yīng)用面積也不斷擴(kuò)大。隨著無(wú)公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展，接種高效大豆根瘤菌將產(chǎn)生更顯著的社會(huì)與環(huán)境效益[3]。俄羅斯對(duì)根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎(chǔ)并積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[4-5]。2009年黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從全俄大豆科學(xué)研究所引進(jìn)了十多個(gè)高效大豆固氮根瘤菌株，并結(jié)合黑龍江省的生態(tài)環(huán)境特點(diǎn)和大豆主栽品種進(jìn)行綜合研究、開發(fā)和應(yīng)用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，但其生長(zhǎng)較慢，不適合在生產(chǎn)上加以應(yīng)用，因此有必要研究、改良培養(yǎng)基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，提高大豆根瘤菌的培養(yǎng)速度。本研究主要通過(guò)優(yōu)化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養(yǎng)基，篩選出最適合根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，為實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為引進(jìn)的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學(xué)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)用培養(yǎng)基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（2）SM培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（3）TY培養(yǎng)基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0。（4）PA培養(yǎng)基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養(yǎng)基上28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d后接種到Y(jié)MA培養(yǎng)液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。

1.3.3 培養(yǎng)基的比較 在600 nm下測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗(yàn) 在培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基上進(jìn)行碳源的篩選試驗(yàn)。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養(yǎng)基中的甘露醇，同時(shí)保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養(yǎng)基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、24、36、48h時(shí)測(cè)定D600 nm。

1.3.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化 在常規(guī)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)大豆根瘤菌的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。進(jìn)行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設(shè)計(jì)方案對(duì)培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)5種培養(yǎng)基的篩選表明，YMA培養(yǎng)基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長(zhǎng)。碳源利用試驗(yàn)表明，葡萄糖為最優(yōu)碳源。正交試驗(yàn)得到GF菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補(bǔ)至1 000 mL。優(yōu)化的根瘤菌YMA培養(yǎng)基在避免資源浪費(fèi)和降低生產(chǎn)成本的前提下，實(shí)現(xiàn)了根瘤菌的大量、快速生長(zhǎng)，為根瘤菌工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[6]。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45（1）：57-61.

[2]譚 娟. 接種俄羅斯大豆根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響[J]. 作物雜志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)科技出版社，1994.

[4]張 武. 俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態(tài)適應(yīng)性[J]. 作物雜志，2010（3）：54-55.

[5]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（1）：50-53.

[6]吳紅慧，周俊初. 根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和劑型的比較研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（2）：14-19.

摘要：將引進(jìn)的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，相關(guān)生長(zhǎng)情況的試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在YMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快。在YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行的碳源利用試驗(yàn)表明，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中根瘤菌生長(zhǎng)得最好。按L9（34）正交設(shè)計(jì)表對(duì)YMA培養(yǎng)基中的4個(gè)組分比例進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析可得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補(bǔ)足至1 000 mL。

關(guān)鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個(gè)體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉(zhuǎn)化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況、提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經(jīng)成為世界各國(guó)豆科作物增產(chǎn)、減少化肥施用的一項(xiàng)技術(shù)措施，在許多國(guó)家都有大規(guī)模商品菌劑的生產(chǎn)和出售，應(yīng)用面積也不斷擴(kuò)大。隨著無(wú)公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展，接種高效大豆根瘤菌將產(chǎn)生更顯著的社會(huì)與環(huán)境效益[3]。俄羅斯對(duì)根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎(chǔ)并積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[4-5]。2009年黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從全俄大豆科學(xué)研究所引進(jìn)了十多個(gè)高效大豆固氮根瘤菌株，并結(jié)合黑龍江省的生態(tài)環(huán)境特點(diǎn)和大豆主栽品種進(jìn)行綜合研究、開發(fā)和應(yīng)用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，但其生長(zhǎng)較慢，不適合在生產(chǎn)上加以應(yīng)用，因此有必要研究、改良培養(yǎng)基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，提高大豆根瘤菌的培養(yǎng)速度。本研究主要通過(guò)優(yōu)化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養(yǎng)基，篩選出最適合根瘤菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，為實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為引進(jìn)的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學(xué)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)用培養(yǎng)基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（2）SM培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0。（3）TY培養(yǎng)基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0。（4）PA培養(yǎng)基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養(yǎng)基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養(yǎng)基上28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d后接種到Y(jié)MA培養(yǎng)液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。

1.3.3 培養(yǎng)基的比較 在600 nm下測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗(yàn) 在培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基上進(jìn)行碳源的篩選試驗(yàn)。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養(yǎng)基中的甘露醇，同時(shí)保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養(yǎng)基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、24、36、48h時(shí)測(cè)定D600 nm。

1.3.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化 在常規(guī)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)大豆根瘤菌的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。進(jìn)行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設(shè)計(jì)方案對(duì)培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)5種培養(yǎng)基的篩選表明，YMA培養(yǎng)基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長(zhǎng)。碳源利用試驗(yàn)表明，葡萄糖為最優(yōu)碳源。正交試驗(yàn)得到GF菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補(bǔ)至1 000 mL。優(yōu)化的根瘤菌YMA培養(yǎng)基在避免資源浪費(fèi)和降低生產(chǎn)成本的前提下，實(shí)現(xiàn)了根瘤菌的大量、快速生長(zhǎng)，為根瘤菌工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[6]。

參考文獻(xiàn)：

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