李小婷等

摘要：沙棘葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)、類黃酮等次生代謝物質(zhì)，用普通方法提取沙棘葉片總RNA時很難將其去除。本試驗以沙棘葉片為材料，比較研究了改良Trizol法、 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）、RNAplant Plus總RNA提取試劑以及RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法等4種方法對沙棘葉片總RNA的提取效果。結(jié)果表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法能從沙棘葉片中提取純度較高的RNA，凝膠電泳顯示條帶清晰完整，鮮葉平均得率為298.1 μg/g，D260 nm/D280 nm 比值為1.79，用該方法提取的沙棘葉片總RNA可以用于后續(xù)的分子生物學研究中。

關(guān)鍵詞：沙棘葉片；總RNA提??；提取方法

中圖分類號： S793.604 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0033-02

提取獲得純度高、質(zhì)量好的RNA是進行cDNA第一鏈合成、RT-PCR、RACE-PCR、cDNA全長克隆和Northern雜交等分子生物學研究的必要前提[1-2]。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），又名醋柳、酸刺，是胡頹子科沙棘屬（Hippophae）的灌木或小喬木。沙棘廣泛分布于黃土高原、毛烏素沙地及其毗鄰地區(qū)，在水土保持、防風固沙及治理砒砂巖等方面發(fā)揮著重要的生態(tài)作用[3]。沙棘葉片中含有大量的多糖、多酚、粗蛋白、類黃酮等次生代謝物質(zhì)[4]，加之RNAase的廣泛存在，使獲得純度較高的沙棘葉片總RNA變得十分困難。傳統(tǒng)提取RNA的方法有異硫氰酸胍法、苯酚法、SDS法、CTAB法、Tris-硼酸法及Trizol法等，這些方法可以有效地提取大部分動物組織RNA，但高等植物組織內(nèi)含有一些多糖類和酚類物質(zhì)，使用這些方法很難去除[5]。本試驗采用4種RNA提取試劑 （盒） 進行系統(tǒng)比較分析，以期篩選出提取高質(zhì)量沙棘葉片總RNA的方法，為開展沙棘后續(xù)分子生物研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的沙棘葉片采自陜西省定邊縣西南林業(yè)大學實習基地，為移栽后2年的實生苗嫩葉，采后迅速放入液氮中帶回實驗室-80 ℃保存。

試驗所用主要試劑有Trizol （Invitrogen公司產(chǎn)品）、RNA simple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型） （天根公司產(chǎn)品）、RNAplant Plus 總RNA提取試劑 （天根公司產(chǎn)品），DEPC （Sigma公司），其他試劑均為RNA試驗專用。

1.2 方法

1.2.1 改良Trizol法 按照Invitrogen 公司試劑說明書進行，并加以改進：取0.1 g沙棘葉片液氮研磨成細粉后加 0.1 g PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 繼續(xù)研磨，待液氮揮發(fā)后將混合粉末迅速加入已裝好Trizol的1.5 mL無RNAase離心管中，搖勻前迅速加入10 μL β-巰基乙醇；加入氯仿之前加 200 μL 5 mol/L NaCl 混勻；氯仿抽提，取上清后加入等體積酚-氯仿-異戊醇（體積比25 ∶ 24 ∶ 1），重新抽提1次。

1.2.2 RNAsimple總RNA提取試劑盒（離心柱型） 參照天根公司試劑盒說明書進行。

1.2.3 RNAplant Plus總RNA提取試劑法 參照天根公司試劑說明書進行。使用前按照1 ∶ 4的體積比將β-巰基乙醇與RNAplant Plus reagent混合。

1.2.4 RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法 在加氯仿之前按1 ∶ 250的體積比加入DNA酶Ⅰ，輕輕吹打混勻 1 min，然后參照天根公司試劑說明書進行。

1.2.5 總RNA的完整性檢測 分別取5μL總RNA樣品，在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，EB（溴化乙錠）中染色后，凝膠成像系統(tǒng)成像觀察，記錄結(jié)果。

1.2.6 總RNA的純度檢測 將用4種方法提取的總RNA分別取2 μL，用無RNAase的DEPC水稀釋50倍，在核酸蛋白儀上測定D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm值，分析其純度。

得率（μg/g）=D260 nm×40（μg/mL）×稀釋倍數(shù)×RNA原液體積（mL）/所取樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘葉片總RNA完整性分析

4種不同方法提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 （圖1），結(jié)果表明，改良TRIzol法和RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 的凝膠電泳未檢測出RNA；RNAplant Plus 總RNA提取試劑法得到的沙棘總RNA電泳圖譜可以看到亮度很高的28S和18S 2條帶，且28 條帶與18S條帶亮度比約為2 ∶ 1，但在28S上方可見明顯的其他條帶，表明有基因組DNA雜質(zhì)；而RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ之后成功地去除了DNA，并且對總RNA質(zhì)量、濃度影響不大。

2.2 沙棘葉片總RNA純度分析

用改良Trizol法、 RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心

柱型）、RNAplant Plus總RNA提取試劑法以及RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法4種方法提取沙棘葉片總RNA，在核酸蛋白儀上進行分析，結(jié)果如表1所示。

一般認為較純凈的RNA樣品，其D260 nm/D280 nm應為 1.7～2.0，D260 nm/D230 nm應大于2.0。由表1可見，改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型）提取的RNA的D260 nm/D280 nm分別為1.47和1.28，均小于1.7，表明這2種方法提取的RNA樣品純度較差，不能有效去除總RNA樣品中蛋白質(zhì)或酚類等有機物雜質(zhì)。同時，這2種方法提取的總RNA樣品的D260 nm/D230 nm分別為0.33和0.79，表明這2種方法也不能有效地去除其中的萜類化合物等次生代謝物。RNAplant Plus總RNA提取試劑法提取法的RNA樣品D260 nm/D280 nm大于1.7，表明這種方法可以去除蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的干擾；但D260 nm/D230 nm小于2.0，可能是受到基因組DNA的干擾。而RNplant Plus 總RNA提取試劑改良法提取的RNA D260 nm/D280 nm為1.79，D260 nm/D230 nm為2.07，表明這種方法提取的RNA純度高，不存在多糖、蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)等雜質(zhì)。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產(chǎn)率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產(chǎn)量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數(shù)據(jù)綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結(jié)論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關(guān)鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質(zhì)與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續(xù)反應[6]。多糖的理化性質(zhì)與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產(chǎn)量的下降[7-8]；而酚類物質(zhì)殘留在樣品中會發(fā)生氧化產(chǎn)生深褐色的物質(zhì)[9]，所以使用傳統(tǒng)方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內(nèi)源RNase都會使RNA發(fā)生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產(chǎn)物的干擾，從而得到質(zhì)量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質(zhì)，孫德權(quán)等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質(zhì)的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質(zhì)膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質(zhì)的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質(zhì)往往是影響RNA提取效果的關(guān)鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質(zhì)量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產(chǎn)率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產(chǎn)量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數(shù)據(jù)綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結(jié)論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關(guān)鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質(zhì)與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續(xù)反應[6]。多糖的理化性質(zhì)與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產(chǎn)量的下降[7-8]；而酚類物質(zhì)殘留在樣品中會發(fā)生氧化產(chǎn)生深褐色的物質(zhì)[9]，所以使用傳統(tǒng)方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內(nèi)源RNase都會使RNA發(fā)生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產(chǎn)物的干擾，從而得到質(zhì)量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質(zhì)，孫德權(quán)等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質(zhì)的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質(zhì)膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質(zhì)的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質(zhì)往往是影響RNA提取效果的關(guān)鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質(zhì)量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產(chǎn)率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產(chǎn)量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數(shù)據(jù)綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結(jié)論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關(guān)鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質(zhì)與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續(xù)反應[6]。多糖的理化性質(zhì)與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產(chǎn)量的下降[7-8]；而酚類物質(zhì)殘留在樣品中會發(fā)生氧化產(chǎn)生深褐色的物質(zhì)[9]，所以使用傳統(tǒng)方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內(nèi)源RNase都會使RNA發(fā)生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產(chǎn)物的干擾，從而得到質(zhì)量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質(zhì)，孫德權(quán)等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質(zhì)的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質(zhì)膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質(zhì)的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質(zhì)往往是影響RNA提取效果的關(guān)鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質(zhì)量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。